5. Tính mới của đề tài
3.1.1.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và BA đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá
từ mô lá
Phân tích số liệu (Bảng 3.2) cho thấy, môi trường nuôi cấy có NAA được bổ sung BA với các mức nồng độ (0,25; 0,5; 1 mg/L) thì kết quả tạo phôi có khác biệt về thống kê giữa các nghiệm thức. Điều đó chứng tỏ, sự kết hợp của NAA và BA có ảnh hưởng đến sự phát sinh phôi. Nhận thấy, khi sử dụng BA (0,25; 0,5; mg/L) kết hợp với NAA (3, 4, 5 mg/L) mô lá có biểu hiện đáp ứng tích cực, các chỉ tiêu theo dõi đều cao hơn khi môi trường nuôi cấy bổ sung auxin (NAA) riêng lẻ, không kết hợp với BA, cụ thể tỷ lệ mẫu cấy tạo phôi và số phôi/mẫu tăng, cao nhất ở nghiệm thức có 5 mg/L NAA kết hợp với 0,25 mg/L BA (tỷ lệ mẫu tạo phôi là 94,44% và 28,56 phôi/mẫu), cao hơn nghiệm thức đối chứng 5 mg/L NAA (tỷ lệ mẫu tạo phôi 88,89% và 19,95 phôi/mẫu). Nhưng các nghiệm thức có NAA (3, 4, 5 mg/L) khi bổ sung 1 mg/L BA, thì mẫu cấy tạo phôi chậm, tỷ lệ tạo phôi và số phôi/mẫu đều giảm, thấp nhất ở nghiệm thức có 5 mg/L NAA và 1 mg/L BA (tỷ lệ mẫu tạo phôi 57,78% và 9,67 phôi/mẫu). Như vậy, khi bổ sung BA với nồng độ tối ưu đã phát huy vai trò của NAA trong quá trình phân bào và phát sinh phôi vô tính trực tiếp với hiệu quả
cao nhất. Từ kết quả trên cho thấy, sự hiện diện của auxin (NAA) kết hợp với cytokinin (BA) là cần thiết cho quá trình phát sinh phôi NGBCC, sự tương tác này có tác động tích cực và hiệu quả khi nồng độ của chất ĐHST thích hợp (Hình 3.4D,E). Bảng 3.2. Ảnh hưởng của kết hợp NAA và BA đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từmảnh lá, ở môi trường SH, 60 NSC.
NAA (mg/L) 3 4 5 3 4 5 3 4 5 3 4 5
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan. Số liệu (%) được chuyển đổi sang dạng arcsin √
khi phân tích thống kê.
Trong nuôi cấy in vitro, đa số các thực vật (có khuynh hướng tái sinh phôi) đều có nhu cầu auxin và cytokinin nhằm đáp ứng tạo phôi vô tính. Auxin ngoại sinh/bổ sung giúp điều hòa và cân bằng lượng auxin nội sinh [70], cytokinin cùng với auxin kích thích sự phân bào, và cả hai có tác động cộng hưởng đối với nhiều quá trình sinh học ở thực vật và mô nuôi cấy, do vậy cũng có vai trò quan trọng trong tạo phôi [82]. Ở NGBCC, tổ hợp NAA và BA ở nồng độ thích hợp đã cho kết quả tạo phôi tích cực - phù hợp với nhận định chung về vai trò kết hợp của auxin và cytokinin đối với tạo phôi như đã nêu trên.
Hình 3.4. Mảnh lá tạo phôi trực tiếp ở môi trường SH có NAA và BA, 60 NSC.
A,B,C. Môi trường SH có 4 mg/L NAA và BA 0,25; 0,5; 1 mg/L; D,E,F. Môi
trường SH có 5 mg/L NAA và BA 0,25; 0,5; 1 mg/L. Thanh ngang 5 mm.
Kết quả tác động tích cực của BA đối với sự hình thành phôi NGBCC ở nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Kharwanlang và cộng sự (2016a) khi bổ sung thêm kinetin/BA (0,25 – 5 mg/L) vào môi trường dùng tạo phôi Panax pseudoginseng [71]. Trong nuôi cấy in vitro, đa số các thực vật (có khuynh hướng tái sinh phôi) đều có nhu cầu auxin và cytokinin nhằm đáp ứng tạo phôi vô tính. Auxin ngoại sinh/bổ sung giúp điều hòa và cân bằng lượng auxin nội sinh [70], cytokinin cùng với auxin kích thích sự phân bào và cả hai có tác động cộng hưởng đối với nhiều quá trình sinh học ở thực vật và mô nuôi cấy và do vậy cũng có vai trò quan trọng trong tạo phôi [82]. Từ nuôi cấy mảnh lá mầm phôi hợp tử Cucumis sativa trên môi trường có BA ở điều kiện chiếu sáng, Li và cộng sự (2007) nhận thấy BA, ngoài tác động làm tăng kích thước mảnh lá mầm cũng đã làm tăng hàm lượng cytokinin nội sinh [5]. Qua nghiên cứu mối liên quan giữa hàm lượng chất ĐHST nội sinh với các giai đoạn phát triển khác nhau của phôi vô tính từ nuôi cấy mô phôi hợp tử Ormosia henryi, Gaoyin và cộng sự (2020) [12] nhận thấy hàm lượng auxin đạt cao ở giaiđoạn phát triển và sự phân cực của phôi (tỷ lệ IAA/CKs, AUX/CKs cao), và hàm
lượng cytokinin cũng cao ở giai đoạn trưởng thành và nẩy mầm của phôi (tỷ lệ IAA/CKs, AUX/CKs giảm).
Như vậy, chất ĐHST ngoại sinh có vai trò không thể thay thế trong cảm ứng tạo phôi vô tính và nồng độ của chúng ảnh hưởng đến sự cân bằng chất ĐHST nội sinh trong đó có cytokinin, giúp điều hòa sự tăng trưởng và phát sinh hình thái. Ở NGBCC, tổ hợp NAA và BA ở nồng độ thích hợp đã cho kết quả tạo phôi tích cực - phù hợp với nhận định chung về vai trò kết hợp của auxin và cytokinin đối với tạo phôi như đã nêu trên.
3.1.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá
Kết quả sau 60 ngày nuôi cấy (Bảng 3.3, Hình 3.5) cho thấy, nồng độ sucrose 50 g/L ở trường hợp chiếu sáng đã có ảnh hưởng tích cực nhất đến sự phát sinh phôi vô tính (Hình 3.5C) so với các trường hợp nồng độ sucrose còn lại và so với trường hợp để mẫu trong tối, tỷ lệ mẫu tạo phôi và số phôi/mẫu lần lượt là 98,89% và 35,95 phôi/mẫu. Khi nồng độ sucrose cao đã làm tăng khả năng giữ nước của môi trường, tế bào nhận nước từ môi trường kém thuận lợi - mô khô hơn do vậy kích thích sinh lý tế bào biến đổi mạnh, tạo thuận lợi cho quá trình phát sinh phôi. Khi nồng độ sucrose ở môi trường nuôi cấy tăng cao 70 g/L làm tỷ lệ mẫu tạo phôi và số phôi/mẫu giảm (tương ứng là 87,78% và 18,72 phôi/mẫu), do áp suất thẩm thấu tăng cao nên tế bào bị ‘sốc’ thiếu nước, sinh lý tế bào bị ức chế, trao đổi chất giảm. Khi nồng độ sucrose giảm còn 10 g/L thì quá trình tạo phôi giảm rõ rệt, phát sinh hình thái chậm dù vẫn ở điều kiện sáng. Nghiệm thức có 50 g/L sucrose ở điều kiện tối không khác biệt về mặt thống kê so với nghiệm thức 10 g/L sucrose ở điều kiện sáng khi xét về tỷ lệ % mẫu tạo phôi, nhưng số phôi/mẫu có khác biệt rõ. Như vậy, với các mức nồng độ sucrose khác nhau trong điều kiện chiếu sáng khác nhau đã có ảnh hưởng khác biệt lên hiệu quả phát sinh phôi vô tính trực tiếp từ mô lá NGBCC, ở điều kiện chiếu sáng phát sinh phôi hiệu quả hơn trong điều kiện tối hoàn toàn, vì ở điều kiện chiếu sáng có ảnh hưởng đến quang hợp của mẫu cấy.
Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, mô và tế bào thực vật sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng hoặc bán dị dưỡng nhờ điều kiện ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp, mẫu cấy chủ yếu sử dụng dinh dưỡng từ môi trường nuôi cấy. Vì vậy, việc bổ sung đường vào môi trường nuôi cấy và bố trí mẫu cấy ở những
điều kiện chiếu sáng khác nhau có ý nghĩa rất lớn cho sự phát sinh hình thái, phát sinh phôi. Đường đối với cơ thể thực vật là yếu tố không thể thiếu trong cung cấp năng lượng và khung carbon cho sự phát triển của tế bào. Đường còn giúp điều hòa áp suất thẩm thấu, bảo vệ tính toàn vẹn của màng tế bào, quyết định hình dạng và sự phát triển của tế bào [12].
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá, ở môi trường SH, 60 NSC
Điều kiện nuôi cấy Sáng
Tối
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0, 05 trong phép thử Duncan. Số liệu (%) được chuyển đổi sang dạng
(x+0,5)1/2 khi xử lý thống kê.
Đã ghi nhận được công trình công bố đường ở nồng độ 50 g/L thúc đẩy khả năng phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo phôi hợp tử cây dược liệu quan trọng Terminalia chebula [114]. Nồng độ đường 50 g/L là nồng độ tối ưu cho sự phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) [74]. Ở họ Ngũ gia bì, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy đường được sử dụng như vừa là tác nhân tạo áp suất thẩm thấu cao và chất dinh dưỡng đã tạo ảnh hưởng rất tích cực lên quá trình tạo phôi, ví dụ [36] đã cải thiện được chất lượng và tần số tạo phôi Panax quinquefolius trực tiếp qua kết hợp tiền xử lý (pretreatment) mẫu lá mầm với tác nhân đường (342,3 g/L, ở 4oC) với nuôi cấy mẫu sau đó trên môi trường cảm ứng tạo phôi có nồng độ đường cao (70 g/L); ngoài ra, Kim và cộng sự (2010) cũng đã ghi nhận tần số tạo phôi đơn Panax ginseng trực tiếp (ở 2 giống Yun-Poong và Chun-Poong) cao nhất khi mảnh lá mầm phôi non được nuôi cấy trên môi trường MS có 70 g/L đường và tần số tạo
phôi đơn tăng cao khi xử lý gây co nguyên sinh (plasmolysis) mẫu bằng đường (0,1 – 0,5 – 1 M, trong 24 h) trước khi cấy mẫu vào môi trường [115].
Hình 3.5. Phôi vô tính phát sinh trực tiếp từ mảnh lá ở môi trường SH, có đường và điều kiện sáng, tối, 60 NSC
A,B,C,D. Phôi hình thành ở môi trường SH có sucrose 10, 30, 50 và 70 g/L, điều kiện sáng. E,F,G,H. Phôi hình thành ở môi trường SH có sucrose 10, 30, 50 và 70 g/L, điều kiện tối. Thanh ngang 10 mm.