PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.3. Phương pháp đánh giá kiểu hình tính kháng bệnh bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo
nhiễm nhân tạo
a. Nguồn vi khuẩn bạc lá phục vụ cho lây nhiễm nhân tạo
- Các nòi vi khuẩn bạc lá mới có độc có độc tính cao được thu thập và phân lập trong thời gian thực hiện đề tài.
- 10 chủng vi khuẩn bạc lá đại diện cho miền Bắc và miền Trung Việt Nam do Viện Di truyền Nông nghiệp thu thập, phân lập, đánh giá và chọn lọc thông qua lây nhiễm nhân tạo trên bộ dòng lúa chuẩn mang đơn và đa gen kháng bệnh bạc lá do IRRI cung cấp. Đây là những chủng được phân lập năm 2015 và 2016, có độc tính cao và ổn định (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Chủng vi khuẩn bạc lá đại diện cho miền Bắc và miền Trung Việt Nam do Viện Di truyền Nông nghiệp thu thập, phân lập
STT Tên chủng 1 VX041 2 NĐ4-2 3 X12.4 4 X19.2 5 X22.2 6 VXO13 7 X5-1NA 8 X15-1 9 X21.1 10 X17
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng 3 chủng vi khuẩn bạc lá để tiến hành lây nhiễm nhân tạo là: Chủng 2 (NĐ4-2), chủng 7 (X5-1NA) và chủng 10 (X17).
b. Phương pháp đánh giá tính kháng/nhiễm bệnh bạc lá * Chuẩn bị dòng/giống lúa:
- Chuẩn bị hạt giống gồm: Dòng lúa nhiễm chuẩn (IR24), bộ giống lúa mang đơn và đa gen kháng do IRRI cung cấp và nguồn vật liệu nghiên cứu của đề tài.
- Gieo trồng các dòng giống lúa. Cây mạ 3-4 lá được cấy ra ruộng. Cây lúa 40-45 ngày sau cấy được sử dụng trong thí nghiệm đánh giá tính kháng/nhiễm bệnh bạc lá. . Diện tích mỗi ô thí nghiệm là 20 m2. Mật độ cấy 45 khóm/m2.
* Pha dịch khuẩn:
- Cấy khuẩn từ nguồn bảo quản ra môi trường PSA, ủ 28oC trong 24-48h.
- Khi khuẩn mọc, cấy chuyển tiếp ra các đĩa môi trường PSA để nhân khuẩn. Ủ 28oC trong 48h.
- Dùng nước cất khử trùng đổ vào đĩa khuẩn đã mọc kín đĩa, lấy que trang thủy tinh gạn hết khuẩn, sau đó đổ dịch khuẩn thu được vào trong ống falcon. Chỉnh nồng độ khuẩn đạt 108-109 CFU.
* Nhiễm khuẩn trên lá lúa:
- Nhiễm 5 lá/cây: Dùng đầu kéo nhúng vào dịch khuẩn, cắt đầu lá lúa chiều dài khoảng 5 cm Mỗi một lần cắt lại nhúng lại kéo vào dịch khuẩn.
- Khi đổi chủng khuẩn nhiễm phải khử trùng kéo với cồn 96%
- Đối chứng âm được làm với nước cất khử trùng.
- Tiến hành đo kích thước vết bệnh sau khi nhiễm 15 ngày.
* Đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn bạc lá:
Đo chiều dài vết bệnh. Thang điểm dựa trên thang đánh giá bệnh tiêu chuẩn (IRRI, 2013). (Bảng 3.2)
Bảng 3.2. Thang điểm đánh giá khả năng kháng bạc lá theo chiều dài vết bệnh (IRRI, 2013)
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN