Phần 5 Kết luận và kiến nghị
3.1. Sơ đồ tổng quát quá trình thực hiện các nội dung nghiên cứu
3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Đánh giá đặc điểm nông sinh học 3.5.1. Đánh giá đặc điểm nông sinh học
Các giống lúa sƣu tập đƣợc đƣợc gieo trồng trên ruộng thí nghiệm của Trung tâm Tài nguyên Thực Vật tại An Khánh, Hoài Đức, Hà Nội, Việt Nam (21o00’02’’N và 105o43’07’’E), trong vụ mùa 2011. Thí nghiệm đƣợc bố trí kiểu RCBD với 03 lần nhắc lại. Mỗi ơ thí nghiệm có diện tích 1 m2, trong đó kích thƣớc dài x rộng là 1,0 m x1,0 m; khoảng cách giữa 2 ô và giữa các hàng cây trong ô là 0,25 m; xung quanh ruộng thí nghiệm đƣợc bao bọc bởi hàng lúa bảo vệ rộng 2,5 m bằng giống lúa LT3.
Thời gian ra hoa đƣợc kiểm tra và ghi lại trong suốt thời gian trỗ của các giống tại thời điểm số cây trỗ đạt 10%, 50% và 85% giống thí nghiệm. Căn cứ vào thời gian trỗ này chúng tôi chia ra các giống thí nghiệm ra làm 5 nhóm: Nhóm cực ngắn ngày (Very Early – VE) có thời gian từ gieo đến trỗ bơng ≤ 75 ngày; Nhóm ngắn ngày (Early -E) có thời gian từ gieo đến trỗ bơng 75 < E ≤ 85 ngày; Nhóm trung bình (Medium –M) có thời gian từ gieo đến trỗ bơng 85< M ≤ 105 ngày; Nhóm dài ngày (Late – L) có thời gian từ gieo đến trỗ 105 < L ≤ 135 ngày; và nhóm rất dài ngày (Very Late – VL) có thời gian từ gieo đến trỗ > 135 ngày. Thời gian sinh trƣởng (từ gieo đến khi hạt chín sinh lý) cũng đƣợc ghi nhận cho mỗi giống, phân loại tổng thời gian sinh trƣởng của các giống lúa dựa trên thang chuẩn của IRRI.
Hạt giống thu đƣợc đƣợc phơi khơ, sau đó 30 hạt của mỗi giống đƣợc chụp ảnh với độ phân giải cao và đƣợc đo kích thƣớc chiều dài hạt (Length - L) và chiều rộng hạt (Width – W) bởi phần mềm phân tích ảnh Image J (Schneider
et al., 2012), 10 hạt/giống, ở cả 3 lần lặp, sau đó lấy trung bình cộng. Căn cứ vào
kích thƣớc hạt, chúng tơi chia làm 3 nhóm: Nhóm hạt dài – có tỷ lệ L/W >3,0 (ký hiệu là A); Nhóm hạt bầu – có 2,5 < L/W < 3,0 (ký hiệu là B); và Nhóm hạt trịn – có tỷ lệ L/W <2,5.
Đặc điểm nội nhũ của của mỗi giống cũng đƣợc kiểm tra nhanh bằng thí nghiệm với dung dịch I-ốt, các hạt gạo lật đƣợc cắt làm đôi và nhúng vào dung dịch chứa 0,2% I2, và 2% KI (Juliano and Villareal, 1993), và quan sát sau 10 phút. Tại vết cắt của hạt lúa nếu xuất hiện màu xanh đậm thì giống đó là lúa tẻ, ngƣợc lại, nếu xuất hiện màu nâu thì đó thuộc nhóm lúa nếp.
Các thơng tin đánh giá đặc điểm nông học đƣợc biểu diễn trên các cây phân loại di truyền bằng các ký hiệu tƣơng ứng.
3.5.2. Chiết tách ADN tổng số
ADN đƣợc chiết tách bằng phƣơng pháp CTAB (Murray and Thompson, 1980). Vật liệu đƣợc sử dụng là lá của cây lúa đƣợc 6 tuần tuổi sau cấy. Chất lƣợng ADN sau khi chiết tách đƣợc kiểm tra bằng máy đo quang phổ ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm, đồng thời đƣợc kiểm tra trực quan bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose cùng với các băng ADN đối chứng có nồng độ tiêu chuẩn. Các ADN đảm bảo chất lƣợng sau đó sẽ đƣợc pha lỗng tới nồng độ 100 ng/µl để sử dụng cho các thí nghiệm phân tích kiểu gen với DArT và SNPs marker.
3.5.3. Phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị DArT
Để phân tích đa dạng di truyền của tập đồn giống lúa nghiên cứu chúng tôi sử dụng chỉ thị phân tử DArT (Diversity Array Technology) đƣợc mô tả bởi Killian et al. (2012). Thí nghiệm đƣợc tiến hành với hệ thống máy móc chuyên
dụng của Phịng thí nghiệm DArT, thuộc Trung tâm Hợp tác quốc tế Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp bền vững (CIRAD) – Pháp. Một thƣ viện gồm 6144 DArT marker đƣợc xây dựng bởi Phòng nghiên cứu Di truyền –CIRAD –Pháp, sử dụng 25 giống chỉ thị, gồm 10 giống indica, 10 giống japonica ôn đới và 5
giống japonica nhiệt đới (Bảng 3.1). Phƣơng pháp xây dựng thƣ viện DArT đã
đƣợc mô tả bởi Jaccoud et al. (2001) cùng Risterucci et al. (2009). Các bƣớc
chính của DArT đƣợc nghiên cứu sinh khái quát ở Hình 3.1 với sự giúp đỡ và hình ảnh tƣ liệu đƣợc cung cấp bởi Pierre Mournet –kỹ thuật viên trực tiếp hƣớng dẫn nghiên cứu sinh hồn thành các thí nghiệm DArT tại CIRAD –Pháp.
Sau khi chuẩn bị ADN đảm bảo chất lƣợng, ADN của mỗi giống đƣợc cắt bởi 2 loại ezyme cắt giới hạn là PstI (nhận biết điểm cắt bằng 6 nucleotide), và
một ezyme cắt phổ biến hơn là TaqI (điểm nhận biết gồm 4 nucleotide). Sản
phẩm cắt giới hạn đƣợc gắn với adapter của PstI và đƣợc nhân lên nhờ phản ứng PCR, mồi của phản ứng PCR bắt cặp với trình tự của đoạn adapter đã sử dụng. Các sản phẩm PCR sau đó đƣợc clone vào vertor pGEM-T và biến nạp vào E.coli để nhân dòng và tạo thƣ viện. Thƣ viện đƣợc tạo thành từ các dịng ADN có nguồn gốc từ các đoạn cắt giới hạn ban đầu, các dòng này đƣợc giữ riêng và đƣợc khảm lên màng amino trên bề mặt các mảng microarray bằng một máy
chuyên dụng để đảm bảo lƣợng ADN của mỗi dòng đƣợc khảm lên là nhƣ nhau. Trên một mảng microarray đƣợc khảm đầy đủ cả bộ dữ liệu gồm 6144 đoạn ADN đặc hiệu.
Các ADN mẫu mục tiêu đƣợc chuẩn bị tƣơng tự nhƣ cách tạo thƣ viện ADN đối chứng, sau đó đƣợc gắn nhãn với thuốc nhuộm huỳnh quang Cy3/Cy5. Mẫu ADN của các mẫu giống đƣợc lai với ADN đối chứng đã đƣợc gắn trên mỗi mảng thƣ viện microarray. Sau khi các ADN này bắt cặp với nhau, rửa sạch các ADN thừa trên bề mặt mảng lai. Các mảng microarray sau phản ứng lai đƣợc đƣa vào máy quét có khả năng nhận biết tín hiệu phát huỳnh quang ở mỗi vị trí của ADN đối chứng. Tín hiệu màu sắc và cƣờng độ phát huỳnh quang ở mỗi vị trí của 6144 markers đƣợc tính tốn dựa trên phần mềm DArTsoft 7.4.