Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.5. Kết quả phân tích liên kết tồn hệ gen (GWAS)
4.5.2. Các gen ứng viên liên quan đến đặc điểm phát triển bộ rễ
tâm, căn cứ vào kết quả phân tích LD (Linkage Disequilibrium), các gen nằm trong khoảng tin cậy của QTLs đƣợc xác định là các gen ứng viên có liên quan đến tính trạng liên kết. Các gen này đƣợc xác định căn cứ vào bộ dữ liệu các gen trong toàn bộ genome của cây lúa đã đƣợc công bố trên website OrygenesDB (http://orygenesdb.cirad.fr/tools.html). Bằng phƣơng pháp này chúng tơi nhận thấy có 33 QTLs trong tổng số 88 QTLs (Bảng 4.12) nằm trong trình tự của một gen chức năng. Một bộ dữ liệu gồm 889 gen đƣợc xác định cho 88 QTLs, trong đó có 407 gen đã xác định đƣợc chức năng giả định (Phụ lục 4). Các gen liên kết với các QTLs này đã đƣợc so sánh với một danh sách gồm khoảng 200 gen trong bộ dữ liệu các gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ của dự án EURoot, đƣợc công bố trên trang web (http://gohelle.cirad.fr:8080/euroot/JSP/authentication.jsp), chức năng của các gen này đã đƣợc khẳng định, chủ yếu thông qua phƣơng pháp phân tích đột biến, chúng đóng vai trị trong kiến trúc bộ rễ, sự phát triển bộ rễ hoặc vận chuyển nƣớc và dinh dƣỡng qua bộ rễ. Kết quả cho thấy khơng có sự tƣơng hợp nhiều giữa hai bộ dữ liệu này, trừ gen OsPIP2;1 (Os07g26690), tại vị trí có khoảng cách 16 kb kể từ vị trí QTLs số 61 liên kết với THK trên nhiễm sắc thể số 7 (Bảng 4.12). Danh sách các gen này cũng đƣợc so sánh với danh sách các gen có biểu hiện đƣợc biết trong sự hình thành và phát triển rễ bất định (Lafitte et al., 2001; Takehisa et al., 2012). Danh sách của 11 gen có biểu hiện đặc biệt ở các phần khác nhau của rễ lúa nhƣ đỉnh rễ, các vùng đặc biệt của rễ bên và vùng thành thục khác đƣợc trình bày ở Bảng 4.14. Hầu hết các gen này đã đƣợc dự đốn về chức năng hóa sinh nhƣng khơng có các thơng tin chính xác liên quan đến chức năng sinh học của các gen này. Các gen có liên quan đến các QTLs của tính trạng bộ rễ đƣợc lựa chọn để rà soát trên các cơ sở dữ liệu đã có về chức năng sinh học của chúng hoặc đã đƣợc dự đoán chức năng sinh học dựa vào các ortholog của chúng trên Arabidopsis đã đƣợc công bố. Bằng phƣơng pháp này
chúng tôi đã xác định thêm đƣợc 13 ứng viên rất đáng quan tâm, danh sách 13 gen này cũng đƣợc trình bày ở Bảng 4.14.
Chức năng của các gen chứa marker hoặc nằm gần các điểm QTLs có mức ý nghĩa cao đã đƣợc đánh giá. Gen OsPIP2;1 (Os07g26690) ở vị trí 16 kb của
QTLs số 61 (q61) biểu hiện đặc hiệu hơn ở phần ngoại bì (exodermis) của rễ và điều khiển đặc hiệu tăng lên trong rễ của các giống lúa nƣơng sau khi chịu tác động của strees về thẩm thấu (Lian et al., 2006; Sakurai et al., 2008).
Bảng 4.14. Danh sách các gen ứng viên đã đƣợc khẳng định về vai trò và chức năng đối với sự phát triển bộ rễ
QTLID Chr Vị trí của QTL Tính trạng Gen ở lúa
Oryza sativa
Gen ở
Arabidopsis
Chức năng Tài liệu tham khảo
q48 1 2710978-2880907 NR_T Os01g05820 Khơng có Biểu hiện đặc hiệu ở vùng phát
sinh rễ bên
Takehisa et al., 2011
q48 1 2710978-2880907 NR_T Os01g06010 Khơng có Biểu hiện đặc hiệu ở vùng phát
sinh rễ bên
Takehisa et al., 2011
q48 1 2710978-2880907 NR_T Os01g06060 Khơng có Biểu hiện đặc hiệu ở đầu rễ Takehisa et al., 2011
q73 1 5851606 DWB60,
DRW
Os01g10900 At04g18640 ArabidopsisMRH1, phát triển
lông hút
Jones et al., 2006
q73 1 5851606 DWB60,
DRW
Os01g11010 Khơng có Biểu hiện đặc hiệu ở vùng phát
sinh rễ bên
Takehisa et al., 2011
q84 1 6404307 DRP Os01g11860 Khơng có Biểu hiện đặc hiệu ở đầu rễ Takehisa et al., 2011
q49 1 10299033 NR_T Os01g18360 Khơng có OsIAA4, hình thành rễ bất định
cảm ứng với auxin
Song et al., 2013
q36 1 28579082 NCR Os01g49690 At01g50370 ArabidopsisFYPP1, dẫn truyền
tín hiệu, điều chỉnh protein của nhóm gen PIN
Dai et al., 2012
q50 1 42706214 NR_T Os01g73700 Khơng có Biểu hiện đặc hiệu ở đầu rễ Takehisa et al., 2011
q50 1 42706214 NR_T Os01g73720 Khơng có Biểu hiện đặc hiệu ở đầu rễ Takehisa et al., 2011
q66 2 5015093 DW2040 Os02g09760 Không có Biểu hiện đặc hiệu ở đầu rễ Takehisa et al., 2011
q64 2 25990556 DW0020 Os02g43 120 Khơng có Biểu hiện đặc hiệu ở đầu rễ Takehisa et al., 2011
q74 2 30762847 DWB60 Os02g50372 Khơng có Gen ứng viên trong QTLs liên
kết với khối lƣợng rễ ăn sâu
QTLID Chr Vị trí của QTL Tính trạng Gen ở lúa
Oryza sativa
Gen ở
Arabidopsis
Chức năng Tài liệu tham khảo
q38 2 31652149 NCR Os02g51710 At04g39730 ArabidopsisPLAT1, điều hòa
sự phát triển rễ bên
Huyn et al., 2014
q59 3 35166421 THK Os03g63970 At05g51810 OsGA20ox1, nằm trong vùng
QTLs liên quan đến khả năng sống sót ở giai đoạn mạ
Abe et al., 2012
q51 5 16205923-
16458100
NR_T Os05g27920 At05g58440 ArabidopsisSNX2, Vận chuyển
nội bào của PIN2
Jiallais et al., 2006
q60 6 4 649 357 THK Os06g09280 At01g26370 ArabidopsisRID1, sự phát triển
của rễ
Ohtani et al., 2013
q76 6 15 865 171 DWB60 Os06g27980 At03g05390 Biểu hiện đặc hiệu ở đầu rễ Takehisa et al., 2011
q42 7 474 875 NCR Os07g01820 OsMADS15, điều khiển sự phát
triển rễ bất định
Lu et al., 2012; Zhao et al., 2009
q61 7 15 424 576 THK Os07g26740 Khơng có OsRR7, tín hiệu cytokinin Gao et al., 2014;
Bishopp et al., 2011
q61 7 15 424 576 THK Os07g26740 Khơng có Biểu hiện đặc hiệu ở vùng phát
sinh rễ bên
Takehisa et al., 2011
q53 7 22174085-
22175036
NR_T Os07g37010 At04g03270 ArabidopsisCYCLIN D6;1
Hình thành rễ bên
Sozzani et al., 2010
q71 12 1 185 335 DW4060 Os12g03110 Khơng có ArabidopsisMIF1, điều khiển
sự phát triển của rễ
Hu and Ma, 2006
q71 12 1 185 335 DW4060 Os12g03150 At01g08810 ArabidopsisMYB60, điều khiển
sự phát triển của rễ
Oh et al., 2011 Chú thích: QTL ID = ký hiệu của QTLs; Chr = NST; TIL= Số nhánh; NCR = Số lƣợng rễ bất định; THK = Độ dày của rễ; DW0020: Khối lƣợng khô của phần rễ từ 0 đến 20 cm tính từ gốc; DW2040 = Khối lƣợng khô của phần rễ từ 20 đến 40 cm tính từ gốc; DW4060 = Khối lƣợng khô của phần rễ từ 40 đến 60 cm
Việc tìm kiếm chức năng sinh học của các gen liên kết với các QTLs và chức năng của các ortholog của chúng ở Arabidopsis đã ghi nhận một số gen ứng viên rất đáng quan tâm. Ví dụ, sự hình thành và phát triển của rễ bất định ở lúa đã đƣợc chứng minh là chịu ảnh hƣởng của hàm lƣợng auxin tập trung ở các điểm tế bào phát sinh rễ thông qua sự di chuyển của các protein vận chuyển auxin PIN- FORMED, kết quả làm kích hoạt các LBD (LATERAL ORGAN BOUNDARY DOMAIN) của yếu tố phiên mã CRL1 (CROWN ROOT LESS 1) (Inukai et al., 2005; Coudert et al., 2010; Orman-Ligeza et al., 2013). Một số gen nằm trong khoảng tin cậy của QTLs liên quan đến tính trạng số lƣợng rễ chính (NCR) và số lƣợng rễ trung bình /nhánh (NR_T) có liên quan đến đƣờng hƣớng này, có thể kể đến một số gen nhƣ: Os01g49690 (NCR, q36) là một ortholog của gen FYPP1 ở
Arabidopsis. Các gen Fypp1 và Fypp2 là đột biến đôi, đƣợc đặc trƣng bởi sự gia
tăng một PIN protein phosphor hóa dẫn đến kết quả tích lũy của PIN đạt tới đỉnh cao, làm gia tăng quá trình vận chuyển auxin hƣớng gốc, kết quả cho ra kiểu hình bộ rễ ngắn, và hình thành ít rễ bên hơn (Dai et al., 2012). SORTING NEXIN2
(SNX2a), là othorlog trên Arabidopsis của gen Os05g27920 (NR_T, q51), chia sẻ chức năng dự phòng với SNX1, liên quan đến quá trình vận chuyển nội bào của PIN2 thơng qua việc hình thành của SNX1 bên trong các endosomes (Jaillais et
al., 2006). AUXIN/INDOLE-3-ACETIC ACID (IAA) là chất điều hòa âm tính
cảm ứng với auxin và tham gia vào điều hòa biểu hiện của gen CRL1 của auxin (Inukai et al., 2005). Sự biểu hiện quá mức của OsIAA4 (Os01g18360, NR_T, q49) dẫn đến giảm số lƣợng rễ bất định phát sinh sau khi xử lý bởi auxin, cho thấy rằng gen này có thể liên quan đến con đƣờng truyền tín hiệu auxin điều khiển sự hình thành rễ bất định (Song and Xu, 2013). CRL1 điều chỉnh các gen liên quan đến sự hình thành và tạo mơ phân sinh rễ, ví dụ nhƣ SCARECROW
(SCR) hoạt động phối hợp cùng với SHORTROOT (SHR) để kiểm soát sự phân chia của mô phân sinh ở lớp vỏ của nội bì rễ ở Arabidposis hoặc với QUIESCENT CENTER HOMEOBOX (QHB), là một ortholog của gen WOX5
thuộc nhóm gen liên quan đến yếu tố phiên mã WUSCHEL để xây dựng vùng trung tâm tĩnh (Quiescent Center) tại phần chóp rễ, phần gốc rễ, và sự bảo trì các phần rễ, nhất là khi rễ bị tổn thƣơng (Kamiya et al., 2003b; Liu et al., 2005; Cui
CYCLIN D6;1 đƣợc tìm thấy ở Arabidopsis đƣợc xác định là đích trực tiếp của SHR và SCR và liên quan đến các sự kiện trong phân chia tế bào dẫn đến sự hình
thành và phân chia của các mơ phân sinh rễ (Sozzani et al., 2010). Tất cả các gen này có thể liên quan đến đƣờng hƣớng tăng, hoặc giảm của CRL1 trong quá trình điều hịa sự hình thành rễ bất định. Gen OsMADS15 (Os07g01820, NCR, q42)
trong cây siêu biểu hiện đã thể hiện một sự thay đổi trong phát triển bộ rễ, bao gồm sự phát triển quá mức của rễ bất định gắn liền với sự tăng cƣờng biểu hiện của yếu tố phiên mã WOX11 – một gen khác kiểm sốt sự hình thành và phát triển bộ rễ độc lập với đƣờng hƣớng của CRL1 (Zhao et al., 2009; Lu et al., 2012). Gen Os02g51710 là một ortholog của gen PLAT1 (POLYCYSTIN-1, LIPOXYGENASE, ALPHA-TOXIN AND TRIACYLGLYCEROL LIPASE 1) ở Arabidopsis, nó bị kích thích bởi các stress phi sinh học và có vai trị điều chỉnh
tích cực trong sự hình thành và phát triển của rễ bên (Hyun et al., 2014).
Một số gen có chức năng liên quan đến sự phát triển bộ rễ và nằm gần các QTLs liên kết với khối lƣợng rễ ở tầng sâu cũng đã đƣợc xác định. Gen
Os12g03150 (DW4060, q71) là một ortholog của gen AtMYB60 ở Arabidopsis
kiểm sốt sự đóng khí khổng và kích thích sự phát triển của rễ để phản kháng lại tác động hạn hán (Oh et al., 2011). Gen Os12g03110 (DW4060, q71) là một
ortholog của gen MIF1 (MINI ZINC FINGER 1), có vai trị nhƣ một yếu tố điều hòa theo chiều âm liên quan đến sự phát triển của cây, trong đó có sự phát triển bộ rễ (Hu and Ma, 2006). Gen Os01g10900 (DWB60, RDW, q73) là ortholog
của MRH1 (MORPHOCENESIS OF ROOT HAIR 1) ở Arabidopsis, điều chỉnh
sự phát triển của lông rễ (Jones et al., 2005). Cuối cùng là gen Os02g50372
(DWB60, q74), là một protein biểu hiện chức năng chƣa biết nhƣng trƣớc đây đã đƣợc báo cáo là gen ứng cử viên nằm trong vùng QTLs có liên quan đến khối lƣợng rễ ở lớp đất sâu, dựa vào kết quả nghiên cứu biểu hiện gen của Norton et al. (2008).
Liên quan đến độ dày rễ, Os06g09280 (THK, q60) là một ortholog của gen
RID1 (ROOT INITIATION DEFECTIVE 1), gen này tham gia vào các quá trình
phát triển khác nhau, nhƣ bảo trì mơ phân sinh, đặc điểm hình thái của rễ và lá. Trong rễ, RID1 góp phần vào sự biểu hiện đúng đắn của SCR và WOX5, hai gen quan trọng trong quá trình định hình và tổ chức mơ rễ (Ohtani et al., 2013). Gen
Os03g63970 (THK, q59) tƣơng ứng với gen OsGA20ox1 (GIBBERELIC ACID 20 OXIDASE 1) là gen nằm trong vùng một QTL đã đƣợc xác định trƣớc đây khi
nghiên cứu về sức sống của cây lúa ở giai đoạn mạ (Abe et al., 2012). Trong
Arabidopsis, GA, cùng với các gen SCR, SHR, đóng một vai trò rất quan trọng
trong việc điều chỉnh sự khác biệt giữa các lớn tế bào ở phần vỏ của rễ (Paquette and Benfey 2005), do đó, chức năng của gen OsGA20ox1 còn cần phải nghiên
cứu thêm.Tƣơng tự nhƣ vậy, cytokinin cũng đóng vai trị quan trọng cùng với auxin trong tổ chức mạch dẫn cho rễ (Bishopp et al., 2011). Gen Os07g26740
(THK, q61), mã hóa RESPONSE REGULATOR 7 (OsRR7) có thể tham gia vào q trình này.
Việc xác định đƣợc một số gen ứng viên đã đƣợc chứng minh về chức năng sinh học và hóa học bởi các cơng bố về chức năng gen của các nhà khoa học nghiên cứu cùng lĩnh vực ở lúa, cũng nhƣ việc tìm thấy các ortholog của các gen này ở Arabidopsis đã khẳng định sự đúng đắn và ý nghĩa khoa học của đề tài.
Điều này cho thấy các kết quả đã đạt đƣợc là đáng tin cậy và có khả năng ứng dụng vào thực tiễn.
Mặc dù vậy, thực tế là hai gen đƣợc biết đến là ortholog giữa lúa và
Arabipopsis dựa trên sự tƣơng đồng của trình tự khơng đảm bảo hoàn toàn rằng
chức năng của chúng sẽ vẫn đƣợc bảo toàn giữa hai lồi. Bên cạnh đó, cịn rất nhiều gen nằm trong vùng QTLs đã xác định ban đầu vẫn chƣa đƣợc biết về chức năng, hoặc chƣa hiểu biết hết về các chức năng của nó (Wissuwa et al., 2002; Uga et al., 2011). Do đó cần có những nghiên cứu để xác nhận thêm về các QTLs đã đƣợc tìm thấy. Ví dụ: nghiên cứu biểu hiện của tất cả các gen nằm trong khoảng tin cậy của các QTLs này trên tập hợp các giống có kiểu hình tƣơng phản về tính trạng quan tâm. Đây là phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ một tiêu chí để làm giảm số lƣợng gen ứng viên tìm đƣợc trong các vùng QTLs độc lập với chức năng giả định của chúng (Norton et al., 2008b; Abe et al., 2012; Meijon
et al., 2014).