Phần 5 Kết luận và kiến nghị
2.5. Các bƣớc giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger (a) và NGS (b)
Nguồn: Shendure and Ji (2008) Các nucleotide tự do đƣợc đánh dấu huỳnh quang bởi 4 màu khác nhau đặc trƣng cho bốn loại nucleotide khác nhau. Tại đầu 3’ nhóm –OH bị chặn hóa học khiến cho mạch ADN mới tổng hợp đƣợc sẽ dừng lại tại các nucleotide đƣợc đánh dấu. Máy nhận biết tín hiệu huỳnh quang bằng laze sẽ chịu trách nhiệm
nhận biết màu sắc của mỗi nucleotide mới đƣợc gắn vào trong quá trình tổng hợp, hình ảnh nhận biết sẽ đƣợc ghi nhận, sau mỗi lần ghi nhận hình ảnh nhóm – OH tại đầu 3’ sẽ đƣợc loại bỏ chặn hóa học để q trình tổng hợp đƣợc tiếp tục. Hàng loạt các bƣớc này sẽ đƣợc lặp lại mang tính chu kỳ, tùy theo chế độ đƣợc cài đặt bởi ngƣời điều khiển máy mà mỗi chu kỳ có thể đọc đƣợc khoảng 25-35 bp. Mức độ chính xác và chất lƣợng của các chuỗi trình tự đƣợc đọc sẽ đƣợc đánh giá, các chuỗi trình tự có chất lƣợng kém sẽ bị loại bỏ (Mardis, 2008).
2.3.2. Nguyên lý của phƣơng pháp GBS
Sự phát triển của các chỉ thị phân tử ngày càng làm tăng độ chính xác trong việc xác định mức độ đa hình của các quần thể nghiên cứu nhƣng chi phí cao và yêu cầu nhiều nhân lực, trang thiết bị cũng nhƣ cần thời gian khá dài để tiến hành mỗi bƣớc. Sự xuất hiện của các mảng SNP (microarray) đã làm giảm đáng kể thời gian và công sức thực hiện nhƣng việc phát triển các chỉ thị mới vẫn đòi hỏi chi phí đầu tƣ rất cao. Những marker này cũng chỉ đặc trƣng cho quần thể làm cơ sở để phát triển lên bộ chỉ thị đó, dẫn đến kết quả quy chiếu của các alen có thể khác nhau ở các quần thể, các loài khác nhau. Các thơng tin trình tự sơ bộ của các vùng xung quanh các SNPs quan tâm cũng đƣợc sử dụng để phát triển các marker, nhƣng chỉ một tỷ lệ rất nhỏ các SNPs trong các bộ dữ liệu giải trình tự thơng thƣờng có thể đƣợc coi là thích hợp để phát triển marker, bao gồm các SNPs nằm gần các vùng lặp, các vùng marker đã biết hoặc các vùng đáng quan tâm khác. Sự tiến bộ của hóa chất và các phần mềm phân tích dữ liệu đã làm cho giá thành của các nghiên cứu NGS giảm đáng kể, các nghiên cứu giải trình tự đƣợc mở rộng trên phạm vi cả quần thể chứ khơng cịn dừng lại ở một số cá thể có quan hệ họ hàng để tìm kiếm các biến thể, toàn bộ genome đồng thời đƣợc khảo sát và sẽ có hàng trăm nghìn markers đồng thời đƣợc ghi nhận (Elshire et al., 2011). Phƣơng pháp đánh giá kiểu gen dựa vào việc giải
trình tự - “Genotyping by Sequencing” (GBS) đƣợc thực hiện dựa trên nguyên tắc của phƣơng pháp giải trình tự NGS, phƣơng pháp này cũng sử dụng trực tiếp dữ liệu kiểu gen từ các quần thể. Các bƣớc cơ bản để tiến hành một nghiên cứu GBS bao gồm:
Bƣớc 1: Chuẩn bị mẫu ADN;
Bƣớc 2: Lựa chọn enzyme cắt giới hạn và thiết kế các bộ tiếp hợp (adapter) phù hợp với từng thí nghiệm;
Chú thích: Màu xanh đậm là ADN của mẫu 1, màu xanh nhạt là ADN của mẫu 2, vị trí màu đỏ là vị trí cắt của enzyme giới hạn, màu vàng là bộ tiếp hợp có gắn mã hóa 1, màu tím là bộ tiếp hợp có gắn mã hóa 2,
màu xám là vị trí gắn của bộ tiếp hợp thơng thƣờng.