Phần 3 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.5.4. Phân tích kiểu gen thơng qua giải trình tự (GBS)
Thí nghiệm phân tích kiểu gen thơng qua giải trình tự đƣợc thực hiện tại công ty Diversity Arrays Technology Pty Ltd (DArT P/L) - Australia. Phƣơng pháp đƣợc sử dụng do chính cơng ty này xây dựng, kết hợp giữa DArT và cộng nghệ giải trình tự NGS đƣợc gọi tắt là DArTseqTM. Phƣơng pháp DArTseqTM sử dụng các enzyme giới hạn PstI/TaqI để làm giảm sự phức tạp của genome, kết hợp với cơng nghệ đọc trình tự ngắn Illumina, phƣơng pháp này đã đƣợc mô tả rất kỹ trong một công bố của Courtois et al. (2013). Bộ tiếp hợp đặc hiệu với enzyme PstI đƣợc gắn với 96 mã vạch khác nhau, sau đó đƣợc gắn với các đoạn cắt giới hạn đƣợc đặt trong các đĩa ADN khác nhau, 96 mẫu ADN này đƣợc trộn với nhau và lần lƣợt chạy qua máy đọc trình tự Illumina Hiseq2000 theo một chiều duy nhất. Các bộ tiếp hợp PstI đƣợc gắn kèm một trình tự mồi để đảm bảo rằng vị trí đầu tiên đƣợc đọc trình tự ln xuất phát từ vùng trình tự nhận biết của enzyme PstI. Các chuỗi kết quả đƣợc lọc và phân loại tƣơng ứng với các dữ liệu mục tiêu và các trình tự mã vạch đã đƣợc cắt tỉa. Đoạn ADN đã đƣợc cắt tỉa gồm 69 bp (5 bp là trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn, và 64 bp có mức độ đặc hiệu tuyệt đối). Kết quả giải trình tự sẽ đƣợc phân tích bằng phần mềm đƣợc phát triển bởi công ty DArT P/L.
Dữ liệu giải trình tự thơ (raw data) đƣợc công ty DArT P/L bàn giao sau khi việc giải trình tự hồn thành, và đƣợc nghiên cứu sinh tiếp tục xử lý, phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng. Các chỉ thị khơng xuất hiện trong trình tự của Nipponbare và có trên 20% dữ liệu khơng có tín hiệu hoặc dữ liệu không rõ bị loại bỏ khỏi bộ dữ liệu ban đầu. Sau đó, để đáp ứng với yêu cầu của GWAS, các marker có tần số “minor allele” dƣới 5% bị loại bỏ. Các dữ liệu bị khuyết đƣợc khôi phục nhờ sử dụng phần mềm BEAGLE 3.3.2 (Browning and Browning, 2007). Bộ dữ liệu cuối cùng có chất lƣợng tốt nhất đƣợc sử dụng để tiến hành các phân tích cấu trúc quần thể và GWAS.