Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.3. Kết quả phân tích kiểu gen thơng qua giải trình tự (GBS – Genotyping
4.3.1. Kết quả phân tích đa hình và cấu trúc di truyền với SNPs marker
Với tổng số 50000 chỉ thị GBS đã đƣợc sử dụng với 200 mẫu giống lúa, sau khi phân tích kết quả thô, các mẫu giống xuất hiện quá nhiều điểm khuyết dữ liệu kiểu gen sẽ bị loại bỏ. Kết quả, một ma trận haplotype đã đƣợc thành lập bởi 185 mẫu giống lúa, trong đó có 182 giống lúa Việt Nam và 3 giống lúa đối chứng (IR64, Niponbare, Azucena) 25971 marker, có hàm lƣợng thơng tin đa hình
(PIC) biến động từ 1% đến 50%, trung bình là 32,0%.
Để chuẩn bị dữ liệu cho GWAS, các marker có tần số alen thấp (< 5%) bị loại bỏ. Các dữ liệu bị khuyết sẽ đƣợc quy đổi căn cứ vào các dữ liệu đối chứng. Cuối cùng, một ma trận haplotype đƣợc xây dự bởi 185 giống lúa, trong đó có 3 giống đối chứng (IR64, Niponbare, Azucena) và 21623 marker. Các maker đƣợc phân bố đều trong genome với khoảng cách trung bình là 17,1 kb (Hình 4.6). Chúng tơi quan sát đƣợc hai khoảng trống lớn hơn 500 kb trên các nhiễm sắc thể 1, 6, 7, 8 và 11; và 12 khoảng trống có kích thƣớc từ 300 kb đến 500 kb trên các nhiễm sắc thể số 1, 2, 4, 5, 7, 8,và 9.
Chú thích: C là vị trí tâm động của mỗi nhiễm sắc thể; trục tung là chỉ số thơng tin đa hình (PIC); trục hồnh biểu diễn vị trí của marker trên nhiễm sắc thể, kích thƣớc đƣợc tính bằng Mb.
Hình 4.6. Phân bố của GBS marker trên 12 nhiễm sắc thể và hàm lƣợng thông tin đa hình (PIC) của chúng trong ma trận haplotype chuẩn bị cho
nghiên cứu GWAS
Để so sánh và tìm kiếm các vùng QTLs đặc trƣng cho từng nhóm giống, 2
C C C C C C C C C C C C
thuộc nhóm indica (114 giống Việt Nam và IR64) và 64 giống lúa thuộc nhóm japonica (62 giống Việt Nam và Niponbare, Azucena). Số lƣợng marker trong
hai ma trận này lần lƣợt là 13814 và 8821 tƣơng ứng cho từng nhóm giống indica và japonica.
Sự đa hình alen của quần thể đƣợc hình ảnh hóa thơng qua cấu trúc di truyền. Một phân tích cấu trúc di truyền quần thể đƣợc thực hiện trên 1275 SNP marker, kết quả cho thấy tập đoàn 182 giống lúa Việt Nam chia thành hai nhóm rõ rệt gồm 114 giống thuộc loài phụ indica, 62 giống thuộc lồi phụ japonica,
cịn lại là 6 giống thuộc dạng trung gian giữa hai lồi phụ trên. Phân nhóm của các giống trong tập đoàn nghiên cứu gần nhƣ trùng khớp với kết quả trong lần phân tích với các chỉ thị DArT ban đầu. Chỉ có một số trƣờng hợp ngoại lệ: G181 đƣợc phân vào nhóm japonica trong kết quả phân tích với DArT nhƣng ở đây lại đƣợc phân vào nhóm indica; G211 đƣợc phân vào nhóm trung gian khi phân tích với DArT thì theo kết quả GBS lại thuộc nhóm indica, ngƣợc lại G207 ban đầu
theo kết quả của DArT thuộc nhóm indica nhƣng theo GBS lại ở nhóm trung
gian. Các ngoại lệ này xảy ra không ngoại trừ khả năng có sự gắn nhãn sai tại một vài điểm trong q trình đọc tín hiệu ADN, nhƣng cũng có khả năng do số lƣợng SNPs marker đƣợc sử dụng khá lớn (gấp gần 6 lần DArT marker) nên đã tìm ra một số vùng đặc hiệu hơn để nhận biết và phân tách nhóm giống chính xác hơn. Mặc dù vậy, chỉ với 241 marker, kết quả phân tích đa dạng, phân tách nhóm giống của DArT lại gần nhƣ không sai biệt lắm với GBS đã chứng tỏ sức mạnh và độ tin cậy của cơng nghệ DArT trong lĩnh vực phân tích đa dạng di truyền. Song đối với các nghiên cứu GWAS, để đảm bảo mật độ marker cao, bao phủ tồn bộ genome thì thí nghiệm phân tích kiểu gen sử dụng phƣơng pháp GBS với một lƣợng lớn chỉ thị SNPs là rất cần thiết.
Tiến hành phân tích mối quan hệ giữa 115 mẫu giống thuộc loài phụ indica, sử dụng 840 SNP marker đã xác định đƣợc có 6 phân nhóm, đƣợc ký hiệu lần lƣợt từ I1 đến I6, kết quả này một lần nữa đƣợc xác định bằng phƣơng pháp phân tích thành phần chính (DACP) (Jombary et al., 2010); 6 phân nhóm này đƣợc
biểu diễn ở Hình 4.7.
giống thuộc lồi phụ japonica, sử dụng 780 SNPs marker. Kết quả xác định đƣợc 4 phân nhóm và một nhóm trung gian. Sơ đồ cây phân loại đƣợc vẽ bởi phần mềm DARwin và đƣợc trình bày ở Hình 4.8.
Sự khác biệt giữa các phân nhóm đƣợc đo bằng chỉ số FST giữa từng cặp phân nhóm ở cả hai nhóm lồi phụ indica và japonica, đƣợc trình bày ở Bảng
4.4. Qua Bảng 4.4 cho thấy các giá trị FST đều có mức ý nghĩa cao, dao động từ 0,001 đến 0,003. Giá trị FST trong các nhóm japonica là từ 0,428 đến 0,692, cao hơn chỉ số này giữa các phân nhóm trong nhóm indica (0,264 đến 0,555). Số liệu này cũng đƣợc minh chứng qua hình ảnh cây phân loại của hai nhóm, nhóm
indica cây phân loại có cấu trúc gần giống cấu trúc tỏa tròn, cho thấy mối quan
hệ khá gần gũi và khoảng cách di truyền khác đồng đều giữa các phân nhóm, trong khi nhóm japonica chúng ta thấy rõ phân nhóm J3 và phân nhóm J2 gần
nhƣ tạo thành hai cực đối xứng và cách nhau khá xa.
Bảng 4.4. Chỉ số FST giữa các phân nhóm và mức ý nghĩa P-value
indica I1 I2 I3 I4 I5 I6 I1 0,001 0,003 0,001 0,001 0,001 I2 0,303 0,001 0,001 0,001 0,001 I3 0,406 0,453 0,001 0,001 0,001 I4 0,327 0,301 0,498 0,001 0,001 I5 0,374 0,405 0,555 0,381 0,001 I6 0,264 0.270 0,375 0,269 0,347 japonica J1 J2 J3 J4 J1 0,001 0,003 0,001 J2 0,528 0,001 0,001 J3 0,428 0,692 0,001 J4 0,461 0,542 0,676
Trong đó: Giá trị FST đƣợc ghi dƣới đƣờng chéo, giá trị P-value đƣợc ghi phía trên đƣờng chéo tƣơng ứng