2.2.1. Các QTLs liên quan đến sự phát triển bộ rễ lúa
2.2.1.1. Các nghiên cứu xác định QTLs
Ban đầu, để xác định đƣợc các gen điều khiển kiến trúc của bộ rễ các nhà nghiên cứu chủ yếu sử dụng phƣơng pháp di truyền học truyền thống với các phép lai và sơ đồ phả hệ qua từng thế hệ. Với phƣơng pháp này, QTLs đƣợc thiết lập dựa trên mối tƣơng quan giữa sự phân ly giữa kiểu gen và kiểu hình đƣợc tạo ra từ một quần thể lai đƣợc gọi là "quần thể lập bản đồ", tạo ra bằng phƣơng pháp lai thuận nghịch và lai lại (backcrossing). Nghiên cứu đầu tiên về kiến trúc bộ rễ ở lúa đƣợc công bố bởi Champoux et al. (1995) đã mở đầu cho hàng loạt các
công bố khác sau đó. Kết quả của những nghiên cứu này đã đƣợc tóm tắt bởi Kamoshita et al. (2008), cho quần thể lập bản đồ CT9993/IR622266 (Kamoshita
et al., 2008); và bởi Khowaja et al. (2009) cho quần thể lập bản đồ
Bala/Azucena. Trong bài tổng quan của mình Courtois et al. (2009) đã phân tích những điều kiện thiết lập của 675 QTLs trong 24 nghiên cứu ở 12 quần thể lập bản đồ riêng biệt; những hệ thống đánh giá kiểu hình rất đơn giản, thông thƣờng
là sử dụng hệ thống thủy canh, hoặc hệ thống thí nghiệm chậu vại, ống rễ với giá thể chủ yếu là đất, là đặc trƣng cho những nghiên cứu trong giai đoạn này. Phần lớn các trƣờng hợp (368 trong tổng số 675 QTLs) điều kiện đánh giá kiểu hình là để đánh giá và ƣớc lƣợng khả năng di truyền; chỉ có rất ít các nghiên cứu phân tích cụ thể các QTLs liên quan đến khả năng cảm ứng với các điều kiện thiếu hụt về nƣớc hoặc là khả năng đâm sâu của rễ (147 và 160 QTLs, tƣơng ứng). Các chỉ tiêu đƣợc đo đếm thƣờng là: Chiều dài rễ, độ dày của rễ, số lƣợng rễ, khối lƣợng rễ ở các độ sâu khác nhau, tỷ lệ giữa phần rễ và phần thân của cây. Quần thể lập bản đồ thƣờng đƣợc sử dụng là các dòng thuần tự phối (RILs) hoặc là các dòng quần thể đơn bội kép (DHLs) bởi vì bản chất tự nhiên ổn định của các dòng cho phép lặp lại các phép đo. Để tối đa hóa sự khác biệt giữa hai bố mẹ và đơn giản hóa việc xác định sự đa hình, hầu hết các quần thể (8/12 quần thể, tƣơng ứng với 560 QTLs) đã sử dụng đƣợc tạo ra từ phép lai giữa một indica và một japonica. Kích thƣớc của các quần thể lập bản đồ này thƣờng ở mức nhỏ (khoảng từ 100 đến 150 cá thể), cho phép xác định một vài QTLs với hiệu ứng rộng nhƣng có độ phân giải thấp (Courtois et al., 2009). Mặc dù sự tƣơng tác giữa QTLs x Môi trƣờng đã đƣợc khẳng định là khá lớn (Kamoshita et al., 2002; MacMillan et al., 2006) nhƣng có một vài vùng nhiễm sắc thể thƣờng xuyên xuất hiện ở các quần thể và/hoặc ở các môi trƣờng thí nghiệm khác nhau, điều này đƣợc rút ra sau khi tổng hợp và so sánh kết quả QTLs ở các nghiên cứu khác nhau (Courtois et al., 2009; Khowaja et al., 2009). Các tính trạng có số lƣợng QTLs đã đƣợc xác định nhiều nhất theo từng cụm QTLs trên các nhiễm sắc thể khác nhau (Chr1 (30-40 Mb), Chr2 (25-35 Mb), Chr3 (0-5 Mb), Chr4 (30-35 Mb), Chr9 (15-20 Mb), đƣợc trình bày thông qua đồ thị ở Hình 2.4.
Gần đây, những hệ thống đánh giá hình thái bộ rễ thông lƣợng cao và công nghệ dựng ảnh 3D đã đƣợc sử dụng cho các thí nghiệm đánh giá kiểu hình làm tăng độ tin cậy và ý nghĩa của các QTLs xác định đƣợc, mở ra một hƣớng đi mới đầy triển vọng, tập trung chủ yếu ở các tính trạng bƣớc đầu nhƣ: mật độ rễ và mức độ lan sâu, rộng của rễ; thêm vào đó là các chỉ tiêu cơ bản nhƣ: các đặc trƣng cho độ dài của rễ, và các chỉ tiêu đặc trƣng cho diện tích của rễ (Topp et
al., 2013). Nghiên cứu này sử dụng quần thể lập bản đồ Bala/Azucena và đã xác
định đƣợc một số QTLs có liên quan đến các tính trạng đơn giản, và xác định đƣợc một số QTLs hoàn toàn mới.
Chú thích: R/S, là tỷ lệ khối lƣợng giữa phần rễ và phần thân; RN, là số lƣợng rễ bất định; MRL, chiều dài bộ rễ; THK, đƣờng kính rễ.
Hình 2.4. Số lƣợng QTLs liên kết với đặc điểm bộ rễ ở lúa trên các vùng nhiễm sắc thể
Nguồn: Mai et al. (2014)
Hạn chế cơ bản của các QTLs đƣợc thiết lập bằng cách sử dụng các quần thể lập bản đồ là khoảng tin cậy của QTLs có kích thƣớc rất lớn. Ngay cả các phân tích tổng hợp, sử dụng giá trị trung bình cũng không có khả năng làm giảm khoảng tin cậy của các QTLs tổng hợp xuống còn một nửa kích thƣớc ban đầu của nó (Courtois et al., 2009). Phƣơng pháp GWAS sử dụng các quần thể tự nhiên cho thấy sự phân rã LD (Linkage Disequilibrium) một cách nhanh chóng đã xuất hiện nhƣ một công cụ mạnh mẽ để cải tiến độ phân giải tại mỗi vị trí QTLs so với phƣơng pháp sử dụng quần thể lập bản đồ. GWAS đòi hỏi số lƣợng marker với mật độ rất lớn trên mỗi nhiễm sắc thể, điều này chỉ có thể thực hiện đƣợc nhờ sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ giải trình tự hiện đại ngày nay. Những kết quả đầu tiên của phƣơng pháp phân tích GWAS trên các tính trạng bộ rễ lúa vừa đƣợc công bố (Shen et al., 2001; Clark et al., 2013; Courtois et al., 2013).
2.2.1.2. Các gen được phân lập từ các QTLs liên quan đến sự phát triển bộ rễ ở lúa
Các kết quả lập bản đồ QTLs liên quan đến sự phát triển bộ rễ ở lúa đã đƣợc tiếp tục nghiên cứu thông qua phát triển các dòng NILs có chứa các QTLs trên các nền di truyền khác nhau, các QTLs liên kết chặt với các vị trí cloning (Shen et al., 2001; Steele et al., 2006; Steele et al., 2013). Hầu hết các QTLs có tác động đến một số tính trạng kiểu hình quan trọng đã đƣợc công bố vị trí chính xác để có thể phân lập. Ví dụ đầu tiên phải kể đến là gen liên quan đến khả năng hút photphos của lúa ở đất có hàm hƣợng photphos thấp PUP1 (PHOSPHORUS
UPTAKE 1), sau đó là gen PSTOL1 (PHOSPHORUS-STARVATION TOLERANCE 1), đã đƣợc clone và đƣợc chứng minh mã hóa một “receptor-like
cytoplasmic kinase” (Gamuyao et al., 2012). Gen này không thấy biểu hiện ở Nipponbare. Cây mang gen siêu biểu hiện của gen này có hàm lƣợng lân (P) trong thân tăng lên đáng kể và năng suất tăng 60% trong điều kiện thiếu lân (P) so với cây đối chứng. Các gen này có tác dụng làm tăng sự phát triển ở giai đoạn sớm của rễ, làm cho bộ rễ có kích thƣớc lớn hơn, chiều dài và diện tích bề mặt của rễ tăng, góp phần làm tăng khả năng hút lân (P), và các dinh dƣỡng khác nhƣ đạm (N), kali (K). Gen này biểu hiện ở vùng phát sinh rễ bất định (CR) và tại mô phân sinh của nó tại vùng gốc thân. Vị trí biểu hiện của gen này chứng tỏ nó liên quan đến sự điều khiển việc hình thành và và kéo dài của rễ bất định.
Một gen khác đã đƣợc clone từ một QTLs liên kết với tính trạng phát triển bộ rễ là gen DRO1 (DEEPER ROOTING 1) (Uga et al., 2013; Uga et al., 2015). Biểu hiện của DRO1 đƣợc điều khiển bởi auxin thông qua yếu tố phiên mã ARF (Auxin Response Factor -ARF transcription factors). DRO1 điểu khiển tính
hƣớng địa của rễ, cũng nhƣ thông qua việc điều khiển sự kéo dài của tế bào biểu bì theo khả năng tăng trƣởng của rễ định hƣớng theo sự lôi kéo của trọng lực. Sự biểu hiện của DRO1 trên nền di truyền IR64 làm tăng độ mở của góc giữa rễ và trục ngang trên mặt đất, là nguyên nhân dẫn đến sự ăn sâu hơn của bộ rễ. So với IR64, các dòng đẳng gen (dòng NILs) mang gen DRO1 có một số hiệu ứng
không mong muốn nhƣ lá rủ, thời gian ra hoa chậm hơn (kéo dài thời gian sinh trƣởng), tuy nhiên, trong điều kiện hạn thì có năng suất cao hơn, và không suy giảm năng suất so với cây đối chứng ở điều kiện thƣờng.
Quá trình cloning hai QTLs có tác động trực tiếp hoặc gián tiếp lên kiến trúc bộ rễ này là tiêu biểu cho các khó khăn gặp phải trong quá trình xác định các QTLs liên quan đến các tính trạng rễ lúa. Khó khăn thứ nhất, là khó khăn chung đối với tất cả các tính trạng, đó là sự sai lệch khá lớn giữa vị trí marker với vị trí gen liên kết với tính trạng quan tâm. Khó khăn thứ hai, là bởi sự khác biệt trong cấu trúc của các nhóm giống khác nhau (Schatz et al., 2014), và trong một nhóm, giữa các giống, sự vắng mặt của gen PSTOL1 trong giống lúa đối chứng
Nipponbare là một minh họa. Một lý do nữa, đó là có rất nhiều gen trong genome hiện nay chƣa đƣợc làm rõ chức năng. Ví dụ, sản phẩm của gen DRO1 là một
protein không có sự tƣơng đồng về chức năng với các protein đã đƣợc biết đến (Uga et al., 2013). Mặc dù số lƣợng các gen đƣợc clone từ các QTLs còn khá hạn chế, nhƣng sự xuất hiện của DRO1 và PSTOL1 với những chức năng quan trọng liên quan đến sinh trƣởng và phát triển bộ rễ đã chứng minh hiệu quả và ý nghĩa của phƣơng pháp này. Do đó, để khắc phục các nhƣợc điểm và nâng cao hiệu quả nghiên cứu cần làm giảm kích thƣớc của khoảng cách từ điểm đánh dấu đến các gen quan tâm, sử dụng GWAS là một biện pháp trong đó; bên cạnh đó các nghiên cứu di truyền, khai thác sự đa dạng của lúa cần kết hợp với các phƣơng pháp phân tích chức năng gen hiện đại để kiểm tra và chứng thực chức năng sinh học của gen nhƣ phƣơng pháp làm câm gen hoặc gây siêu biểu hiện gen trong các điều kiện đặc thù.
2.2.2. Các gen liên quan đến sự hình thành và phát triển bộ rễ lúa
Giải trình tự và giải mã genome lúa (Yu et al., 2002; Itoh et al., 2007), cũng nhƣ việc tạo ra một bộ sƣu tập các đột biến (Hirochika et al., 2004; Krishnan et
al., 2009; Guiderdoni and Gantet, 2012; Lorieux et al., 2012; Wei et al., 2013) và
các nghiên cứu sàng lọc sự biến đổi của kiểu hình rễ của các dạng đột biến đó cho phép chúng ta xác định đƣợc các gen chính điều khiển sự hình thành, sự xuất hiện và sự phát triển của rễ lúa (Rebouillat et al., 2009; Coudert et al., 2010; Orman-Ligeza et al., 2013). Căn cứ vào phƣơng thức tác động và vai trò của gen đó trong quá trình hình thành và phát triển bộ rễ ở lúa mà có thể phân thành những nhóm gen khác nhau.
2.2.2.1. Các gen điều khiển sự hình thành và phát triển bộ rễ cảm ứng với auxin
Các nghiên cứu sinh lý, hóa sinh và di truyền ở thực vật đã lần lƣợt khẳng định vai trò của auxin trong sự hình thành và phát triển bộ rễ ở thực vật nói
chung và ở lúa nói riêng. Quá trình sinh tổng hợp và vận chuyển auxin và tín hiệu của nó đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự tăng trƣởng và phát triển của rễ, có thể nói auxin nhƣ một chất điều hòa tổng thể trong quá trình này. Những công bố gần đây đang dần hé lộ cơ chế tác động của auxin đến quá trình hình thành và phát triển bộ rễ lúa thông qua hoạt động của một mạng lƣới gen và các yếu tố phiên mã cảm ứng với auxin đƣợc tìm thấy.
Đột biến crown root less 4 (crl4) đƣợc biến đổi từ OsGNOM1, gen mã hóa
sự vận chuyển guanine-nucleotide qua màng cho ARFs (ADP-ribosylation fator), một thành viên của gia đình protein G (Kitomi et al., 2008; Liu et al., 2009). Protein G, hay còn gọi là “protein nucleotide-binding guanine”, là một gia đình các protein hoạt động nhƣ một thiết bị chuyển mạch phân tử bên trong tế bào, có liên quan trong việc truyền tín hiệu từ một loạt các kích thích bên ngoài một tế bào vào bên trong qua màng tế bào. Hoạt động của chúng đƣợc quy định bởi các yếu tố kiểm soát khả năng gắn kết và thủy phân guanosine triphosphate (GTP) thành guanosine diphosphate (GDP). Protein G là một thành viên của nhóm lớn các enzyme có tên là GTPases. Sau yếu tố này là một dạng tƣơng đồng của GNOM1, nó điều khiển mạng lƣới vận chuyển nội bào của protein vận chuyển auxin PIN1 (PINFORMED1) trong Arabidopsis. Đổi lại, PIN1 là yếu tố cần thiết để tập trung auxin vào các tế bào hình thành rễ bên (Steinmann et al., 1999; Kitomi et al., 2008; Liu et al., 2009). Đột biến crl1 và Osgnom1 đã đƣợc đánh giá dựa trên sự vắng mặt của các rễ bất định và sự suy giảm số lƣợng các rễ bên. Trong các đột biến này, sự biểu hiện của một vài gen OsPIN đã bị thay đổi.
Trong đột biến crl4, sự vận chuyển auxin bị suy yếu đi làm cho sự phân bố auxin trong các tế bào gốc rễ bị thay đổi (Kitomi et al., 2008). Kết quả cho thấy vị trí vận chuyển auxin có liên quan tới sự hình thành rễ bất định và rễ bên ở lúa.
OsWOX3A (WUSCHEL-releted homeobox 3A) đƣợc mã hóa bởi NAL2 (NARROW LEAF2) và NAL3 là một cặp gen lặp. Cặp đôi đột biến nal2/nal3 biểu
hiện một kiểu hình phức tạp, làm thay đổi sự phát triển của các bộ phận khác nhau của cây, đáng chú ý là nó làm giảm mạnh mật độ của các rễ bên. Một hiệu ứng đáng chú ý khác của đột biến này là làm tăng số lƣợng và chiều dài của các lông hút (Cho et al., 2013). Trong đột biến nal2/nal3 sự biểu hiện của các gen
OsPIN khác nhau đã đƣợc biến đổi. Kết quả của sự biến đổi này đƣợc giải thích
bằng giả thuyết cho rằng có sự tăng vận chuyển auxin tới các mô biểu bì, nơi phát sinh lông hút, đồng thời làm giảm lƣợng auxin vận chuyển tới trụ bì
(pericycle) nơi các rễ bên đƣợc phân hóa (Yoo et al., 2013). OsTIR1 và OsAFB2 là hai gen ở lúa có cùng nguồn gốc với các cơ quan cảm thụ auxin (receptor) TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE 1 (TIR1) và AUXIN SIGNALING F- BOX2 (AFB2) ở Arabidopsis, đƣợc làm bất hoạt bằng OsMir393a và OsMir393b (Bian et al., 2012; Xia et al., 2012). Cây siêu biểu hiện OsMir393 thể hiện kiểu
hình biến đổi do tác động dây chuyền của các tín hiệu liên quan đến auxin, bao gồm cả sự suy giảm số lƣợng rễ bất định. OsMir393a biểu hiện rõ ở các vị trí phát sinh rễ chính và rễ bên, điều này chỉ ra rằng OsMir393a có liên quan đến việc điều khiển sự hình thành của rễ ở sau giai đoạn rễ mầm thông qua việc phủ định sự điều khiển của các chất nhận (receptor) auxin ở lúa. Các chất nhận auxin TIR1 và AFB2 đƣợc định vị trong nhân, nơi mà chúng có thể tƣơng tác với OsIAA1 - một protein điều khiển AUXIN/INDOLE ACETIC ACID (AUX/IAA) (Bian et al., 2012; Xia et al., 2012). Protein AUX/IAA tƣơng tác và ức chế ARF (Auxin Response Factors), có chức năng nhƣ một yếu tố phiên mã. Ở
Arabidopsis, khi các chất nhận này đƣợc tạo phức hợp với auxin, nó có thể tƣơng
tác với các protein AUX/IAA. Kết quả của sự ràng buộc này là do sự hoạt động của enzyme gắn ubiquitin (là các protein điều khiển có kích thƣớc nhỏ, khoảng 8,5 kDa) SKP1- CULLIN- FBOX (SCF), mà các ubiquitin sử dụng là các AUX/IAA, mục tiêu của nó là làm suy giảm hàm lƣợng auxin trong các tế bào phát sinh rễ, từ đó có thể làm giảm số lƣợng rễ hình thành. Những sự tƣơng tác này đòi hỏi phải có một hoặc vài protein đi kèm (chaperone hoặc co-chaperone) (Guilfoyle and Hagen, 2007; Mockaitis and Estelle, 2008; Vanneste and Friml, 2009; Lavenus et al., 2013).
Ở lúa, một sàng lọc các đột biến mất khả năng cảm ứng với auxin để đánh giá đặc điểm của của hai đột biến (Oscyclophilin2 (Oscyp2) và lateral root less2
(lrl2)) đã đƣợc xác định dựa vào sự vắng mặt của các rễ bên mà nguyên nhân của
sự vắng mặt này là do đột biến ở trên cùng một gen (Kang et al., 2013; Zheng et
al., 2013). Ngoài ra, Oscyp2 còn thể hiện một loạt các kiểu hình không cảm ứng
với auxin mà tƣơng quan với sự suy giảm nồng độ của OsIAA11 để phản hồi lại với auxin. OsCYP2/LRL2 là một protein đi kèm, nó có thể tƣơng tác với co- chaperone OsSGTS (SUPPRESSOR OF G2 ALLELE OF SKP1). Một số giả thiết cho rằng phức hợp này có liên quan đến sự suy giảm của OsIAA11 do SCFTIR trong quá trình phản hồi lại với auxin trong giai đoạn sớm của sự phân hóa rễ bên (Kang et al., 2013).
OsIAA11 hoặc OsIAA13 gia tăng chức năng đột biến, trong đó, các axit amin có liên quan đến sự suy giảm của các protein cảm ứng với auxin đã đƣợc