Phần 3 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.5.7. Phƣơng pháp đánh giá kiểu hình bộ rễ
3.5.7.1. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc thực hiện trong nhà lƣới chống côn trùng tại Trạm thực nghiệm Văn Giang - Viện Di truyền Nông nghiệp, thuộc xã Liên Nghĩa - huyện Văn Giang - Hƣng Yên, đƣợc thiết kế theo kiểu alpha-lattice với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp gồm 200 giống lúa đƣợc chia làm 10 khối (block), mỗi khối chứa 20 giống. Các khối đƣợc bố trí để hạn chế tác động của yếu tố môi trƣờng đến sinh trƣởng phát triển của các giống trong mỗi một lần nhắc lại.
Thí nghiệm áp dụng phƣơng pháp ống rễ cải tiến để phù hợp với mục đích, và điều kiện thực hiện thí nghiệm tại Việt Nam. Cây lúa đƣợc trồng trong các “ống” đƣợc tạo thành từ ống nhựa PVC và bên trong là túi nilon đen dài 80 cm, đƣờng kính 16 cm. Giá thể sử dụng là cát sơng, đƣợc trộn đều với nhau và với phân bón NPK 5:10:3 theo tỉ lệ 20 kg phân cho 1 m3 cát. Hạt đƣợc gieo vào ống
sau khi đã đƣợc ủ 03 ngày trong điều kiện 28oC cho nảy mầm trên giấy lọc. Ban đầu gieo 5 hạt/ống, sau khi cây có 1 lá thật thì chỉ giữ lại 01 cây ở chính giữa ống, các cây xung quanh sẽ bị nhổ bỏ đi. Cây đƣợc tƣới 4 lần/ ngày vào các giờ nhất định (6 giờ, 10 giờ, 12 giờ và 18 giờ), trừ khi trời mƣa. Sau gieo 3 tuần, tƣới bổ sung phân bón NPK 15/15/15 hịa tan cho cây với liều lƣợng 2,5g/cây (ống). Bộ rễ đƣợc thu sau 6 tuần kể từ ngày gieo hạt vào ống (45 ngày kể từ khi gieo hạt). Sau khi rửa sạch, bộ rễ đƣợc đánh giá về các tính trạng quan tâm.
3.5.7.2. Các chỉ tiêu theo dõi
Đối với mỗi mẫu thí nghiệm, chúng tơi tiến hành thu thập số liệu của 11 chỉ tiêu sơ cấp gồm: 1) Chiều dài thân: đƣợc tính từ gốc đến đỉnh của lá dài nhất, ký hiệu là LLGTH; 2) Số nhánh: chỉ tính các nhánh đã thực sự xuất hiện từ gốc thân, ký hiệu là TIL; 3) Khối lƣợng khô của phần thân, ký hiệu là SDW; 4) Độ ăn sâu của rễ: là độ dài của rễ khi cịn ngun bầu cát, hay có thể gọi là điểm sâu nhất của rễ khi phát triển trong túi, ký hiệu là DEPTH; 5) Số lƣợng rễ bất định: gồm cả rễ bất định sinh ra từ nhánh chính và các nhánh thứ cấp, đếm ở cách gốc rễ 2 cm, ký hiệu là NCR; 6) Độ dày của rễ: là đƣờng kính của rễ bất định, đƣợc đo bằng kính lúp chuyên dụng tại điểm cách gốc rễ 2 cm, đo 5 rễ/cây, sau đó lấy trung bình cộng của 5 rễ đó, ký hiệu là THK; 7) Khối lƣợng khơ của phần rễ từ 0 đến 20 cm tính từ gốc: cân bằng cân vi lƣợng điện tử, số liệu lấy đến 4 số sau dấu phảy, ký hiệu là DW0020; 8) Khối lƣợng khô của phần rễ từ 20 đến 40 cm tính từ gốc, ký hiệu DW2040; 9) Khối lƣợng khô của phần rễ từ 40 đến 60 cm tính từ gốc, ký hiệu DW4060; 10) Khối lƣợng khô của phần rễ dài hơn 60 cm tính từ gốc, ký hiêu DWB60. 11) Chiều dài rễ tối đa: Đo sau khi bộ rễ đƣợc rửa sạch, ký hiệu là MRL. Chú ý: tất cả các chỉ tiêu liên quan đến khối lƣợng khô mẫu vật điều đƣợc sấy ở 72o
C, liên tục trong 03 ngày cho tới khi kiểm tra thấy khối lƣợng không đổi; số liệu đƣợc cân bằng cân vi lƣợng điện tử, số liệu lấy đến 4 số sau dấu phảy. Có thể hình dung cách thức và vị trí thu thập số liệu theo sơ đồ đƣợc thể hiện trên Hình 3.2.
Các chỉ tiêu thứ cấp lần lƣợt đƣợc tính tốn là: 12) Khối lƣợng khơ của tồn bộ rễ , ký hiệu là RDW; 13) Khối lƣợng khô của phần rễ ăn sâu (phần rễ dài hơn 40 cm), ký hiệu là DRW; 14) Khối lƣợng khô của cả cây lúa (cả thân và rễ), ký
hiệu PDW; 15) Phần trăm khối lƣợng khô của phần rễ ăn nông (DW0020), ký hiệu SRP; 16) Phần trăm khối lƣợng khô của phần rễ ăn sâu, ký hiệu là DRP; 17) Tỷ lệ khối lƣợng khô giữa phần rễ và phần thân cây cũng đƣợc tính tốn, ký hiệu là R_S; 18) Số rễ bất định trung bình/nhánh đƣợc ký hiệu là NR_T.
Trong đó: LLGTH: Chiều dài thân; MRL: Chiều dài rễ tối đa; TIL: Số nhánh; SDW: Khối lƣợng khô phần thân; DEPTH: Độ ăn sâu của rễ; NCR: Số lƣợng rễ bất định; THK: Độ dày của rễ; DW0020: Khối lƣợng khô của phần rễ từ 0 đến 20 cm tính từ gốc; DW2040: Khối lƣợng khơ của phần rễ từ 20 đến 40 cm
tính từ gốc; DW4060: Khối lƣợng khơ của phần rễ từ 40 đến 60 cm tính từ gốc; DWB60: Khối lƣợng khô của phần rễ dài hơn 60 cm tính từ gốc; RDW: Khối lƣợng khơ của tồn bộ rễ lúa; DRW: Khối lƣợng khô
của phần rễ ăn sâu hơn 40 cm tính từ gốc; PDW: Khối lƣợng khô của cả cây lúa (cả thân và rễ); SRP: Phần trăm khối lƣợng khô của phần rễ ăn nông; DRP: Phần trăm khối lƣợng khô của phần rễ ăn sâu; R_S:
Tỷ lệ khối lƣợng khô giữa phần rễ và phần thân cây ; NR_T: Số rễ bất định trung bình trên 1 nhánh.
Hình 3.3. Các chỉ tiêu và vị trí thu thập số liệu các tính trạng liên quan đến sự phát triển bộ rễ của các giống nghiên cứu
3.5.7.3. Phương pháp phân tích số liệu kiểu hình
Sau khi thu thập, số liệu thơ đƣợc nhập vào Excel để kiểm tra và sắp xếp. Sau đó các số liệu đƣợc đƣa vào phân tích phƣơng sai (ANOVA) để xem xét ảnh hƣởng của đa dạng di truyền, số lần lặp và các block đến kết quả thí nghiệm, sử dụng phần mềm SAS 9.2 (SAS Institute, Cary NC, USA). Trung bình bình phƣơng của các giống đƣợc tính tốn để hiệu chỉnh sự mất cân bằng gây ra do hiệu ứng giữa các khối, sử dụng SAS 9.2, từ đó xác định đƣợc giá trị trung bình của mỗi giống ở mỗi tính trạng quan tâm sau khi đã hiệu chỉnh. Giá trị trung bình đã đƣợc hiệu chỉnh sẽ đƣợc sử dụng để tính tốn mối tƣơng quan giữa các kiểu hình giữa các đặc điểm nghiên cứu. Bộ dữ liệu gồm giá trị trung bình đã đƣợc hiệu chỉnh của các giống sẽ đƣợc sử dụng trong phân tích GWAS ở phần tiếp theo. Để làm rõ hơn mối quan hệ giữa sự biến đổi kiểu hình và cấu trúc di truyền, chúng tơi cũng tiến hành phân tích ANOVA cho từng nhóm lồi phụ indica và japonica. Tiến hành phép kiểm định Newman &Keuls để xác định sự sai khác có
ý nghĩa của giá trị trung bình giữa các nhóm lồi phụ (groups) và các phân nhóm dƣới lồi phụ (sub-groups). Trong mỗi tính trạng, tỷ lệ phƣơng sai kiểu hình đƣợc giải thích bởi cấu trúc di truyền đƣợc tính bằng hồi quy kiểu hình trên tỷ lệ phần trăm di truyền bị hỗn tạp trong nền di truyền của giống thuộc nhóm hoặc phân nhóm đó. Các phân tích này đều đƣợc thực hiện bởi phần mềm SAS 9.2 (Inc, 2008). Dựa trên giá trị phƣơng sai kiểu gen và phƣơng sai kiểu hình thu đƣợc sau khi phân tích với SAS 9.2, hệ số di truyền theo nghĩa rộng (H2) cũng đƣợc tính tốn để xác định mức độ ảnh hƣởng của kiểu gen đến giá trị biểu hiện kiểu hình của từng tính trạng theo dõi.
Một phân tích thành phần chính (PCA) đã đƣợc thực hiện để phân tích sự tổ chức của các biến đổi kiểu hình dựa trên giá trị trung bình của các đặc tính theo dõi ở tất cả các giống nghiên cứu. Phân tích này đƣợc thực hiện bởi phần mềm XLStat (Addinsoft, 2012).
Các số liệu liên quan đến đặc điểm thân và bộ rễ của mỗi giống lúa đƣợc khái quát bằng hình ảnh sử dụng phần mềm RASTA (phần mềm đƣợc phát triển bởi Jeremy Lavarence – Sinh viên trƣờng Đại học Montpellier II – Pháp).