5. Bố cục luận văn
1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYM GLUCOSE OXIDASE
1.2.1. Giới thiệu về enzyme glucose oxidase
Glucose oxidase được tiết ra bởi nấm mốc, chủ yếu là Aspergillus niger hay Penicillium amagaskinense. Nó được phân bố giữa dịch ngoại bào, vách tế bào, và trong chất dịch nhầy của nấm mốc. Quá trình tổng hợp glucose oxidase có thể được kích thích bởi các tác nhân khác nhau, bao gồm phân tử oxy, mà nó kích thích sự dịch mã enzyme [9].
Với trọng lượng phân tử 192.000 Dalton. Glucose oxidase là một protein lưỡng phân hình thành từ 2 tiểu đơn vị giống nhau. Mỗi tiểu đơn vị hoặc monomer, cuộn vào trong 2 domain: một domain gắn với cơ chất, β – D – glucose, trong khi đó domain khác liên kết không đồng hoá trị với một nhân tố phụ, flavin adenine dinucleotide (FAD), mà nó sử dụng như một tác nhân oxy hoá mạnh. FAD là thành phần phổ biến trong các phản ứng oxy hoá khử sinh học, nó nhận và cho các điện tử từ một phân tử [9].
Hình 1.13. Cấu trúc không gian của glucose oxidase [21]
Glucose oxidase (GOD) là enzyme xúc tác cho quá trình oxy hoá β – D – glucose thành gluconic acid bằng cách sử dụng oxy làm chất nhận điện tử, đồng thời sinh ra hydropeoxit (H2O2). Gần đây, enzyme GOD nhận được sự quan tâm trong việc ứng dụng rộng rãi trong hoá học, thực phẩm, dược phẩm, hoá học lâm
sàng, công nghệ sinh học và một số lĩnh vực khác. Ứng dụng mới của GOD là sử dụng trong các thiết bị cảm biến sinh học đã làm tăng nhu cầu về enzyme này trong những năm gần đây. Hiện nay, quy trình sản xuất, thu nhận, cố định và ứng dụng mới của GOD đang được xem xét và nghiên cứu sâu hơn, mở ra các hướng ứng dụng mới của GOD vào các lĩnh vực khác nhau [9].
Trong glucose oxidase, FAD hoạt động như một chất nhận điện tử mà làm cho nó bị khử thành FADH2; FADH2 sau đó bị oxy hoá bởi chất nhận điện tử cuối cùng, phân tử oxy, oxy sẽ bị khử thành hydrogen peroxide [9].
Glucose oxidase bản thân nó không hoạt động, nhưng với sự hiện diện của những cơ chất đặc trưng, enzyme được sử dụng để oxy hoá trực tiếp phân tử glucose hoặc oxygen. Nhóm ngoại của enzyme này là FAD. Các sản phẩm chính của phản ứng là gluconic acid và hydrogen [9].
Hình 1.14. Quá trình phản ứng oxy hoá glucose bằng GOD [21]
Phản ứng tối ưu ở điều kiện nhiệt độ 350C và pH bằng 5,1.
1.2.2. Ứng dụng của enzyme glucose oxidase
Trong vài năm gần đây, enzyme glucose oxidase đã đạt được giá trị thương mại lớn vì có rất nhiều ứng dụng trong hóa học, dược phẩm, thực phẩm, nước giải khát, hóa học lâm sàng, công nghệ sinh học và các ngành công nghiệp khác. GOD là enzyme được sử dụng rộng rãi nhất như là một chất thử phân tích để xác định glucose do chi phí tương đối thấp và có tính ổn định tốt. Cách sử dụng GOD là từ thiết bị cảm biến glucose để kiểm soát bệnh tiểu đường, chất bảo quản thực phẩm
và chất ổn định màu. Với enzyme cố định, sự ổn định được cải thiện, khả năng tái sử dụng, hoạt động liên tục, khả năng kiểm soát tốt hơn các enzyme tự do, độ tinh khiết cao và lợi về kinh tế [9].
a. Trong y học, chuẩn đoán bệnh
Enzyme glucose oxidase làm thuốc thử trong hoá phân tích, kháng khuẩn.
Sử dụng glucose oxidase trong phương pháp đo hàm lượng glucose trong máu: Những người bị bệnh tiểu đường cần phải kiểm tra hàm lượng glucse trong
máu thường xuyên để xác định dao động của nồng độ glucose có thể tăng hay giảm trong máu từ đó đưa ra cách điều trị bệnh hợp lý. Gần đây, thiết bị cảm ứng sinh học (Biosensor) được phát triển để dùng cho việc đo hàm lượng glucose và glucose oxidase là một trong những enzyme chủ yếu mà biosensor có thể sử dụng. Sự định lượng chính xác hàm lượng glucose trong máu rất quan trọng trong sự chuẩn đoán và điều khiển sự tăng và giảm đường huyết [9].
Phương pháp sử dụng thuốc thử trong đo lường hàm lượng glucose trong máu: Phản ứng glucose oxidase kết hợp với một phản ứng phụ đã được áp dụng rộng rãi cho việc xác định glucose trong dịnh dịch sinh học. Nhiều phản ứng bổ trợ khác được phát triển để cải tiến toàn bộ hệ thống phản ứng đặc trưng hoặc giữ lại các đặc tính vốn có của glucose oxidase. Phương pháp sử dụng thuốc thử dựa vào phản ứng chỉ thị màu của hydrogen peroxide mà nó kết hợp với 4-aminontipyrine để tạo một phức phenolic [9].
Các giai đoạn phản ứng như sau:
Glucose bị oxy hoá bởi glucose oxidase tạo ra acid gluconic và hydrogen peroxidase.
Glucose + O2 + H2O 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑠𝑒→ Acid gluconic + H2O2
Hydrogen peroxide phản ứng với 4-hydroxy benzoic acid (HBA) và 4- aminoantipyrine (4-AAP) với sự hiện diện của enzyme peroxidase hình thành nên phức chất quinoneimine bắt màu đỏ.
Cường độ màu tạo thành tương ứng với nồng độ glucose và có thể xác định bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng giữa 460 – 560 nm.
b. Pin nhiên liệu sinh học
Các thiết bị sinh học điện tử đòi hỏi khắt khe năng lượng để duy trì hoạt động. Pin nhiên liệu sinh học biển đổi năng lượng sinh hóa thành năng lượng điện bằng cách sử dụng một chất xúc tác sinh học. Một loại pin nhiên nhiệu sinh học sử dụng các enzyme làm chất xúc tác. Ví dụ: GOD và microperoxidase-8 có thể sử dụng trên cathode, tại đó H2O2 sản xuất bởi GOD làm oxy hóa microperoxidase-8 để trực tiếp chấp nhận các điện tử từ điện cực thanh carbon [9].
c. Ứng dụng trong thực phẩm và nước giải khát
- Bảo quản thực phẩm: Glucose oxidase được sử dụng thành công để loại bỏ
glucose và oxy dư trong thực phẩm và đồ uống để kéo dài thời hạn sử dụng. Hydro peroxit được sản sinh ra từ enzyme này hoạt động như một chất diệt vi khuẩn rất tốt và sau đó có thể được loại bỏ bằng cách sử dụng một enzyem thứ hai, CAT chuyển hóa H2O2 thành oxy và nước. GOD/CAT được sử dụng để loại bỏ glucose trong quá trình sản xuất bọt trứng, ngăn ngừa sự biến đổi do oxy hóa và sự tạo màu sẫm ở lớp bề mặt [9].
- Sản xuất bia, rượu: Glucose oxidase có khả năng sử dụng trong công
nghiệp làm rượu, đó là làm giảm độ cồn trong rượu thông qua việc loại bỏ một số glucose (chuyển glucose thành dạng D – glucono – 1,5 – lactonea nếu không sẽ chuyển thành cồn). Mặt khác glucose oxidase có thể ngăn chặn sự hư hỏng của rượu thông qua tác động diệt vi khuẩn acetic acid và vi khuẩn lactic acid trong suốt quá trình lên men [9].
1.3. CỐ ĐỊNH ENZYME LÊN CÁC HẠT NANO OXIT SẮT TỪ
Enzyme, như các chất xúc tác sinh học, thúc đẩy chuyển đổi các phản ứng hoá học có hoạt tính cao, tính chọn lọc và tính đặc hiệu. Mặc dù có hiệu suất xúc tác cao nhưng các enzyme tự do có một số bất lợi quan trọng [40].
Các nhược điểm chính đó là enzyme có thể bị ức chế bởi các chất nền và sản phẩm phản ứng; sự ổn định, hoạt động và tính chọn lọc thấp trong điều kiện khắc
nghiệt. Vì vậy, nên cố định enzyme để tăng cường sự ổn định và hoạt động xúc tác trong các điều kiện khác nhau và phi tự nhiên. Khả năng tái sử dụng của enzyme cố định cũng sẽ khả thi về mặt kinh tế [40].
1.3.1. Định nghĩa enzyme cố định
Các E cố định là những enzyme bị giữ, hoặc được cố định trong một vùng, một khoang nhất định, không bị hòa tan trong các điều kiện bình thường, vẫn giữ được hoạt động xúc tác, có thể sử dụng liên tục và lặp lại nhiều lần. Các chất dùng để gắn hoặc giữ enzyme thường được gọi là chất mang (carrier) hay giá thể (support) [8].
1.3.2. Ưu – nhược điểm của enzyme cố định
a. Ưu điểm
Có thể sử dụng lặp lại nhiều lần một lượng enzyme xác định. Dễ dàng thực hiện quá trình phản ứng liên tục.
Có thể dễ dàng thực hiện các phản ứng kế tiếp nhau của một quá trình phản ứng bằng cách bố trí các bình phản ứng enzyme không tan theo đúng trật tự của quá trình, sản phẩm của phản ứng trước được đưa vào bình phản ứng tiếp theo.
Nếu pH thích hợp của các enzyme này khác nhau, vẫn có thể tìm được điều kiện để các enzyme đều có thể hoạt động tốt.
Dễ dàng ngừng phản ứng một cách đơn giản, mà không cần sử dụng các yếu tố hóa lý nào khác.
Sản phẩm được tách khỏi enzyme, do đó tránh được tác dụng kìm hãm của nó đối với enzyme, và cũng làm cho phản ứng dễ dàng chuyển dịch về phía tạo thành sản phẩm.
Có thể thiết lập mô hình để nghiên cứu các enzyme liên kết với các màng trong hệ thống sống, nghiên cứu ảnh hưởng của vi môi trường lipid đối với hoạt động của các enzyme gắn trong màng. Hiểu biết các vấn đề này giúp ích cho việc mô hình hóa hệ thống sống.
b. Nhược điểm
Trong một số trường hợp, enzyme có thể bị giảm hoặc mất hoạt tính sau quá trình cố định.
Tuy nhiên, những hạn chế trên không đáng kể so với những lợi ích mà enzyme cố định mang lại. Vì vậy, ngày càng nhiều nghiên cứu về cố định enzyme cũng như ứng dụng của enzyme cố định vào các kĩnh vực ra đời.
1.3.3. Tính chất của chế phẩm enzyme cố định
Khi enzyme được cố định trên chất mang, hoạt động của nó bị giới hạn trong một vi môi trường nhất định, nên có những tính chất khác hơn so với khi ở dạng tự do trong dung dịch (dạng hòa tan). Tính chất của enzyme không tan còn phụ thuộc vào phương pháp cố định và bản chất của chất mang [8]. Cụ thể như sau:
a. Hoạt độ riêng (số đơn vị hoạt động tính trên mg hay g protein enzyme)
Thấp hơn ở dạng hòa tan, có thể do:
- Bị cản trở không gian so với khi ở dạng tự do, ảnh hưởng đến sự khuếch tán tự do của cơ chất đến enzyme.
- Sự tiếp xúc với cơ chất bị giới hạn, trong trường hợp enzyme bị giữ trong các mắt lưới của gel, hay bị bọc trong các capsule.
- Bị thay đổi cấu trúc không gian sau khi kết hợp với chất mang bằng liên kết cộng hóa trị, hoặc tạo liên kết chéo giữa các phân tử enzyme.
- Bị kìm hãm hoặc bị biến tính một phần dưới tác dụng của một số yếu tố khác nhau trong quá trình cố định enzyme.
b. Hằng số Km
Enzyme cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis – Menten nhưng hằng số Km biểu kiến có thể thay đổi do:
- Ảnh hưởng trường tĩnh điện của chất mang.
- Sự khuếch tán của cơ chất đến enzyme, có thể không đồng đều giữa lớp gần sát chất mang và các vùng khác.
- Sự khuếch tán của sản phẩm, đặc biệt đối với các enzyme nhạy với sự kìm hãm của sản phẩm.
Do nhiều nguyên nhân đã nêu, Km biểu kiến của enzyme không tan thường cao hơn của ở dạng hòa tan. Khi tăng nồng độ cơ chất, vận tốc khuếch tán của cơ chất đến enzyme cũng sẽ tăng đến một giới hạn nhất định. Nếu giới hạn này đạt được trước khi enzyme được bão hòa hoàn toàn với cơ chất thì V biểu kiến của enzyme cố định sẽ bé hơn khi ở dạng hòa tan [8].
c. Độ bền của enzyme cố định
Độ bền của enzyme cố định có thể không thay đổi, tăng lên hoặc bị giảm tùy thuộc vào khuynh hướng ảnh hưởng của vi môi trường của enzyme đối với sự biến tính. Trong nhiều trường hợp, độ bền của enzyme cố định thường lớn hơn khi ở dạng hòa tan [8].
d. Giá trị pH
pH thích hợp của enzyme có thể thay đổi, nhất là đối với các chất mang tích điện, có thể thay đổi đến 2 đơn vị pH [8].
1.3.4. Phương pháp cố định enzyme
a. Phương pháp hấp phụ
Enzyme được gắn với giá thể bằng cách hấp phụ vât lý trên bề mặt giá thể (hình 1.15). Phương pháp này dễ thực hiện nhất và thường ít ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme. Tuy nhiên, enzyme cũng dễ bị rửa trôi trong quá trình sử dụng lặp lại nhiều lần. Mức độ giữ enzyme trên chất mang, phụ thuộc nhiều vào pH, lực ion. Khi muốn tách enzyme ra khỏi chất mang có thể sử dụng dung dịch có lực ion lớn [22]. Các giá thể được dùng để hấp phụ có dung tích hấp phụ lớn như:
- Cellulose và các dẫn xuất của nó như diethylaminoethyl hoặc carboxymethyl (CM) cellulose [22].
- Dextran và các dẫn xuất dextran: DEAE- và CM-dextran [22]. - Hydroxyllapatile, calcium phosphate [22].
b. Bọc enzyme trong các nang
Phương pháp bọc enzyme trong nang (hình 1.16) thực hiện bằng cách bao bọc các enzyme trong màng bán thấm, tương tự như giữ enzyme trong gel, nhưng bị hạn chế trong không gian. Các protein hoặc enzyme lớn không thể thoát ra, hoặc vào trong viên nang, nhưng các cơ chất và sản phẩm nhỏ có thể đi qua màng [22].
Những vật liệu đã được sử dụng để chế tạo các viên nang có đường kính từ 10 - 100 𝜇m như nylon và cellulose nitrate. Ionotropic gelation của alginates đã chứng minh nó có hiệu quả trong việc bọc các loại thuốc, enzyme và tế bào [22].
Hình 1.16. Bọc enzyme trong các nang [22] c. Giữ enzyme trong gel
Sự cố định bằng cách nhốt enzyme trong gel khác với phương pháp hấp phụ và liên kết cộng hoá trị là enzyme không kết hợp trực tiếp vào giá thể hay chất mang, mà có thể hình dung như là enzyme bị bẫy trong các mắt lưới của lưới (hình 1.17), nên cấu trúc của enzyme không bị biến đổi nhiều. Kích thước của lưới gel được kiểm soát để đảm bảo cấu trúc này đủ bé để ngăn chặn enzyme thoát ra ngoài khi sử dụng, nhưng cũng phải đủ lớn để cơ chất có thể khuếch tán vào đến enzyme và sản phẩm được tạo thành có thể khuếch tán ra khỏi mắt lưới [22].
Các chất có thể tạo gel trong phương pháp này là các chất có cấu tạo mắt lưới như: gelatin, alginate, agarose, polyacryaminde hoặc các polymer tổng hợp.
Hình 1.17. Giữ enzyme trong gel [22]
d. Tạo liên kết chéo giữa các phân tử enzyme
Phương pháp này hoàn toàn không dùng chất mang, mà thường dùng các chất có nhóm chức năng kép, có 2 nhóm chức ở hai đầu hoàn toàn giống nhau, phản ứng với các nhóm chức của các phân tử enzyme khác nhau, tạo ra các liên kết chéo giữa chúng, “khâu” các phân tử enzyme lại với nhau thành các phân tử có kích thước lớn hơn, không tan, có thể tách khỏi dung dịch bằng cách ly tâm hoặc lọc [22].
Các chất thường được dùng vào mục đích này là glutaraldehyde và một số chất khác như dimethylsuberimidate, phản ứng với nhóm amine; hoặc một số chất phản ứng với nhóm carboxyl, nhóm thiol, trong đó glutaraldehyde được dùng phổ biến nhất [22]. Phương pháp tạo liên kết chéo giữa các phân tử enzyme được mô tả ở hình 3.18.
Hình 1.18. Tạo liên kết chéo giữa các enzyme [22]
e. Gắn enzyme vào chất mang rắn bằng liên kết cộng hoá trị
Phương pháp cố định này liên quan đến sự hình thành liên kết cộng hoá trị giữa enzyme và chất mang như ở hình 1.19. Các liên kết cộng hoá trị sẽ tạo liên kết
chặt giữa enzyme với chất mang so với các phương pháp cố định khác vì vậy có thể làm giảm sự thất thoát lượng enzyme sau các quá trình xúc tác [22].
Các liên kết cộng hoá trị được hình thành giữa các nhóm chức trên bề mặt chất mang và các nhóm chức của enzyme (các nhóm amin, carboxyl và cả nhóm thiol) [22].
Hình 1.19. Cố định enzyme bằng liên kết cộng hoá trị [22]
Bảng 1.2. Các phương pháp cố định enzyme lên chất mang bằng liên kết cộng hoá trị [22]
Gắn enzyme vào chất mang bằng liên kết cộng trị thường qua 2 giai đoạn chính:
- Xử lý, hoạt hoá chất mang trước khi gắn enzyme. - Gắn enzyme vào chất mang đã được hoạt hoá.
Một số phương pháp thường được dùng để hoạt hoá chất mang như: dùng