5. Bố cục luận văn
2.4. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC VẬT LIỆU
Nhiễu xạ tia X là một trong những phương pháp phổ biến nhất trong phân tích đặc trưng tính chất của vật liệu rắn (tinh thể và vô định hình) dùng để xác định cấu trúc, thành phần pha dựa trên số lượng, vị trí và cường độ các peak trên phổ để suy đoán kiểu mạng từ đó xác định bản chất của vật thể [1].
Fe3O4 là vật liệu từ tính cấu trúc tinh thể lập phương spinel. Vì vậy, để xác định cấu trúc tinh thể các hạt nano oxit sắt từ đã điều chế và xét sự ảnh hưởng của quá trình biến tính bề mặt, cố định enzyme trên Fe3O4 đến cấu trúc tinh thể Fe3O4
dùng phổ XRD để kiểm tra sự có mặt của các đỉnh nhiễu xạ đặc trưng: (220), (311), (222), (400), (442), (511) và (440).
Thực nghiệm: Trong luận văn này, giản đồ XRD được ghi trên thiết bị
và phần mền phân tích PDXL 2.4.2.0 với tia phát xạ CuK𝛼 có bước sóng 𝜆 = 1,5406 Å, công suất 40 KV, góc quét từ 10 đến 70 độ, nhiệt độ phòng, tốc độ quét 0,020/giây, thời gian một lần quét là 0,7 giây. Mẫu được nghiền mịn trước khi phân tích XRD.
2.4.2. Phương pháp quang phổ hồng ngoại (FT-IR)
Phương pháp phổ hồng ngoại dựa trên cơ sở của sự tương tác giữa chất cần phân tích với các tia đơn sắc có bước sóng nằm trong miền hồng ngoại (400-4000 cm-1) [5]. Mỗi cực đại trong phổ IR đặc trưng cho sự có mặt của một nhóm chức hoặc dao động của một liên kết. Do đó, có thể dựa vào các tần số đặc trưng này để dự đoán sự có mặt của các liên kết hoặc nhóm chức trong phân tử chất nghiên cứu.
Thực nghiệm: Trong luận văn, phổ IR dùng để chứng minh sự hình thành
các liên kết và nhóm chức khi biến tính bề mặt và cố định enzyme lên các hạt nano oxit sắt từ. Phổ IR của các mẫu vật liệu được thực hiện bởi kỹ thuật đo mẫu rắn bằng cách ép viên với KBr, các viên được tạo ra dưới lực ép khoảng 10.000 kg/m2. Phổ hồng ngoại được ghi trên máy Nicolet iS10 FT – IR, phần mềm OMNICTM
9.2.9 trong vùng bước sóng 400 đến 4000 cm-1.
2.4.3. Phương pháp kính hiển vi điện tử quét – truyền qua (SEM – TEM) TEM)
Phương pháp hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscopy, SEM) và hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscopy, TEM) đều sử dụng chùm tia điện tử để tạo ảnh mẫu nghiên cứu.
Phương pháp SEM được sử dụng để nghiên cứu bề mặt của vật liệu, phương pháp này cho biết các thông tin về hình thái của bề mặt và kích thước hạt. Trong khi đó, phương pháp TEM được sử dụng rất hiệu quả trong việc nghiên cứu đặc trưng bề mặt và cấu trúc của vật liệu.
Thực nghiệm: Kỹ thuật chuẩn bị mẫu để ghi ảnh hiển vi điện tử quét (SEM)
là phân tán mẫu vật liệu trên một màn mỏng. Mẫu được ghi ảnh trên máy S4800 – Hitachi. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu để ghi ảnh hiển vi điện tử truyền qua là các mẫu
được phân tán trong dung môi ethanol, sau đó cho lên trên các lưới bằng Cu. Hình ảnh TEM được ghi trên máy JEM1010 – JEOL.
2.4.4. Phương pháp phổ tán xạ năng lượng tia X (EDX)
Phương pháp phổ tán xạ năng lượng tia X (Energy Dispersive X-ray, EDX) là kỹ thuật phân tích thành phần hoá học của mẫu rắn dựa vào việc ghi lại phổ tia X phát ra từ mẫu do tương tác với chùm điện tử có năng lượng cao trong các kính hiển vi điện tử.
Về nguyên tắc, tất cả các nguyên tố có số hiệu nguyên tử từ 4 (Be) đến 92 (U) có thể phát hiện bằng phương pháp này, tuy nhiên không phải tất cả các thiết bị đều đo có thể đo được các nguyên tố nhẹ (Z<10).
Trong luận văn này, phổ EDX được ghi trên máy Emax – Horiba.
2.4.5. Phương pháp từ kế mẫu rung (VSM)
Từ kế mẫu rung (VSM) được phát minh bởi S. Fomer vào những năm 1950 và đang được dùng rất phổ biến. Đây là dụng cụ đo các tính chất từ của vật liệu, hoạt động trên nguyên tắc thu tín hiệu cảm ứng điện từ khi rung mẫu đo trong từ trường. Nó đo momen từ của mẫu cần đo trong từ trường ngoài.
Thực nghiệm: Đường cong từ kế mẫu rung (VSM) được thực hiện tại Trung
tâm đánh giá hư hỏng vật liệu – Viện Khoa học Vật liệu.
2.4.6. Phương pháp phân tích nhiệt DTA/TG
Nguyên tắc: Phân tích nhiệt là nhóm phương pháp theo dõi sự thay đổi tính
chất của vật liệu (mẫu đo) theo sự thay đổi nhiệt độ. Khi cung cấp nhiệt năng thì làm cho nhiệt độ của mẫu tăng lên một giá trị xác định tuỳ thuộc vào nhiệt lượng cung cấp và nhiệt lượng của mẫu. Ở trạng thái vật lý bình thường nhiệt độ của mẫu biến đổi chậm theo nhiệt lượng, nhưng khi có sự chuyển pha (bay hơi, nóng chảy,...) thì sự biến đổi này bị gián đoạn hoặc thay đổi đột ngột. Các quá trình biến đổi này có thể ghi nhận bằng phương pháp phân tích nhiệt.
Phép phân tích nhiệt bao gồm nhiều phương pháp khác nhau. Trong luận văn này, sử dụng phương pháp TG (Thermogravimetry) để đo sự biến đổi khối lượng khi gia nhiệt và phép phân tích nhiệt vi sai quét (Diferential Thermal Analysis, DTA) xác định sự biến đổi của nhiệt lượng truyền qua mẫu.
Thực nghiệm: Trong luận văn này, phương pháp phân tích nhiệt TG – DTA được dùng để xác định sự có mặt của các vật liệu có trên bề mặt của các hạt nano oxit sắt từ nhờ sự biến đổi của vật liệu theo nhiệt độ và hiện tượng mất khối lượng của vật liệu. Các mẫu được đo trong dòng khí trơ N2 từ nhiệt độ phòng đến 8000C với tốc độ gia nhiệt 100C/phút. Thông số của máy phân tích TGA: hệ phân tích nhiệt trọng trường TGA/DSC STA 6000 của hãng Perkin Elmer.
2.5. NGHIÊN CỨU PHẢN ỨNG OXY HÓA GLUCOSO BẰNG HỆ XÚC TÁC Fe3O4 – SiO2 – GOD TÁC Fe3O4 – SiO2 – GOD
2.5.1. Phản ứng oxy hóa glucose bằng hệ xúc tác Fe3O4 – SiO2 – GOD
Glucose oxidase là enzyme xúc tác cho quá trình oxy hoá dung dịch β – D – glucose. Vì vậy để kiểm tra sự gắn kết và đánh giá hoạt tính xúc tác của enzyme sau khi cố định lên chất mang. Tiến hành thực hiện phản ứng oxy hoá glucose bằng hệ xúc tác Fe3O4 – SiO2 – GOD theo sơ đồ hình 2.5.
Hình 2.5. Sơ đồ phản ứng oxy hoá glucose bằng hệ xúc tác Fe3O4 – SiO2 – GOD
Kết thúc phản ứng, để đánh giá hoạt tính xúc tác của enzyme cố định, dùng dung dịch iod để định lượng dung dịch glucose còn thừa sau phản ứng xúc tác bằng phương pháp chuẩn độ ngược.
+ Nguyên tắc phương pháp:
Phương pháp chuẩn độ ngược để định lượng dung dịch glucose như sau: cho một thể tích chính xác dung dịch glucose cần định lượng tác dụng với một thể tích chính xác và dư dung dịch iod. Sau đó dùng dung dịch chuẩn độ natri thiosulfat để định lượng iod thừa:
- Dùng 1 thể tích chính xác và quá dư dung dịch I2 0,1N cho tác dụng với dung dịch glucose, trong môi trường kiềm để oxy hóa triệt để glucose.
20 ml dung dịch glucose C%
0,5g Fe3O4 – SiO2 – GOD Nhiệt độ, thời gian, pH Sản phẩm phản ứng
Đầu tiên Iod sẽ phản ứng với NaOH theo phản ứng sau: I2 + NaOH NaI + NaIO + H2O
Tiếp đó glucose mới bị oxy hóa theo phản ứng:
IO- + CH2OH(CHOH)4-CHO CH2OH(CHOH)4-COOH + I- - Acid hóa bằng dung dịch H2SO4 để lượng Iod dư dưới dạng IO- sẽ chuyển về I2. Chuẩn độ lượng dư I2 này bằng dung dịch Na2S2O3. Ta xác được thể tích Iod dư và cùng với thể tích Iod ban đầu đã biết sẽ xác định được thể tích dung dịch Iod đã phản ứng với dung dịch glucose.
I2(dư) + 2Na2S2O3 Na2S4O6 + 2NaI
+ Tiến trình chuẩn độ:
Hút chính xác 5 ml (trong 20 ml) sau phản ứng xúc tác vào bình nón. Sau đó thêm 30 ml dung dịch I2 0,1N. Nhỏ từng giọt 6 ml dung dịch NaOH 10% vào bình nón, để yên 10 phút. Thêm 16 ml dung dịch H2SO4 10%.
Nhỏ từ từ dung dịch Na2S2O3 0,1N xuống bình nón, lắc đều đến khi có màu vàng rơm thì nhỏ vài giọt hồ tinh bột đến khi xuất hiện màu xanh. Tiếp tục chuẩn độ tới khi mất màu xanh (nhỏ từ từ khoảng 3 – 4 giọt) thì kết thúc. Ghi lại thể tích dung dịch Na2S2O3 0,1N đã dùng.
+ Tính toán kết quả
- Nồng độ glucose còn thừa sau phản ứng được xác định CN (glucose dư) = 𝑉𝐼2×0,1− 𝑉𝑁𝑎2𝑆2𝑂3 ×0,1
5 CM (glucose dư) = CN (glucose dư) / 2
- Nồng độ dung dịch glucose chuyển hóa :
CM (glucose phản ứng) = CM (glucose ban đầu) – CM (glucose dư)
- Số mol glucose còn thừa:
nglucose dư = CM(glucose dư) x V = CM(glucose dư) x 20/1000
- Vận tốc phản ứng (v) được tính bằng nồng độ biến thiên theo thời gian. v = (CM (glucose ban đầu) – CM (glucose dư)) / ∆𝑡
2.5.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa glucose xúc tác bởi Fe3O4 – SiO2 – GOD xúc tác bởi Fe3O4 – SiO2 – GOD
- Ảnh hưởng của nồng độ glucose
- Ảnh hưởng của thời gian phản ứng
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
2.5.3. Thu hồi và tái sử dụng hệ xúc tác Fe3O4 – SiO2 – GOD
Kết thúc quá trình thực hiện xúc tác phản ứng oxy hóa glucose, mẫu Fe3O4 – SiO2 – GODđược thu hồi bằng cách sử dụng nam châm để tách hoàn toàn ra khỏi hỗn hợp dung dịch sau phản ứng. Các hạt nano Fe3O4 – SiO2 – GOD được rửa 3 lần với nước cất sau đó bảo quản ở 40C trong 2 giờ để phục hồi.
Lấy mẫu Fe3O4 – SiO2 – GOD vừa thu hồi tiến hành phản ứng xúc chuyển hóa glucose trong các điều kiện tối ưu đã khảo sát nhiều lần để đánh giá khả năng tái sử dụng.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TỔNG HỢP VẬT LIỆU Fe3O4 – SiO2 – GOD 3.1.1. Tổng hợp nano oxit sắt từ (Fe3O4NP) 3.1.1. Tổng hợp nano oxit sắt từ (Fe3O4NP)
Tiến hành điều chế Fe3O4NP bằng phương pháp đồng kết tủa theo mô tả ở mục 2.1.1.
Hòa tan 5,56 g FeSO4.7H2O và 8 g Fe2(SO4)3 trong 100 ml nước cất bằng khuấy cơ trong 30 phút trong môi trường Ar. Thêm 50ml dung dịch NH3 (25-28%) vào hỗn hợp dung dịch trên đến khi pH=9. Sau khi khuấy trong 60 phút, tăng nhiệt độ phản ứng lên 800C và khuấy thêm 2 giờ trong môi trường Ar. Sau đó, để hỗn hợp dung dịch nguội đến nhiệt độ phòng, các hạt kết tủa được tách bằng nam châm (hình 3.2a) và rửa nhiều lần bằng nước cất và ethanol đến khi đạt môi trường pH =7 [31]. Mẫu được sấy ở 600C trong 3 giờ thu được các hạt nano oxit sắt từ (hình 3.2b).
Sự hình thành các hạt Fe3O4NP được thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1. Dung dịch hỗn hợp Fe2+ và Fe3+ (a), Dung dịch khi bắt đầu cho NH3 (b), Hỗn hợp sau khi phản ứng hết với NH3 (c), Hỗn hợp sau phản ứng ở 800C (d)
Hình 3.2. Các hạt nano Fe3O4 phân tán trong ethanol (a) và sau khi sấy khô (b)
b
a c d
3.1.2. Tổng hợp các hạt coreshell Fe3O4 – SiO2
Chế tạo hạt coreshell có cấu trúc lõi vỏ Fe3O4 – SiO2 bằng phương pháp Stober được mô tả ở mục 2.1.2 và phản ứng được minh họa ở hình 3.3.
Cho 300 mg Fe3O4 vào 80 ml ethanol và 20 ml nước cất, hỗn hợp được rung siêu âm trong 30 phút để các hạt phân tán đều. Thêm từng giọt 3 ml NH4OH tiếp đến là 0,8 ml TEOs vào hỗn hợp trên và khuấy cơ trong 6 giờ ở nhiệt độ phòng trong môi trường Ar. Hỗn hợp sau phản ứng được làm nguội đến nhiệt độ phòng, các hạt kết tủa được tách bằng nam châm sau đó rửa nhiều lần với nước cất và ethanol đến khi đạt môi trường pH=7. Mẫu được sấy ở 600C trong 3 giờ thu được các hạt nano Fe3O4 phủ silica (hình 3.4).
Hình 3.3. Quy trình điều chế hạt nanoshell Fe3O4 – SiO2
Hình 3.4. Các hạt nano Fe3O4 – SiO2 sau khi sấy khô
3.1.3. Tổng hợp Fe3O4 – SiO2 – NH2
Tiến hành hoạt hoá bề mặt các hạt nano Fe3O4 – SiO2 để tạo nhóm amin bậc I bằng (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES). Quy trình điều chế được trình bày ở mục 2.1.3 và phản ứng được minh họa ở hình 3.5.
Hình 3.5. Quy trình điều chế hạt Fe3O4 – SiO2 – NH2
Phân tán 300 mg Fe3O4 – SiO2 trong 40 ml ethanol bằng rung siêu âm trong 30 phút. Thêm nhanh 1 ml (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) vào hỗn hợp trên và khuấy cơ trong 6 giờ ở nhiệt độ 400C trong môi trường khí Ar. Sau đó, hỗn hợp dung dịch được làm nguội đến nhiệt độ phòng. Các hạt Fe3O4 – SiO2 – NH2
được tách bằng nam châm và rửa 5 lần bằng ethanol. Sau đó sấy ở 600C trong 2 giờ thu được các hạt nano Fe3O4 – SiO2 – NH2 như hình 3.6.
Hình 3.6. Các hạt nano Fe3O4 – SiO2 – NH2 sau khi sấy khô
3.1.4. Cố định enzyme glucose oxidase lên Fe3O4 – SiO2 – NH2
Để tổng hợp các hạt nano Fe3O4 – SiO2 – GOD từ tính, tiến hành phương pháp tạo liên kết chéo, sử dụng glutaraldehyde làm cầu nối. Quy trình cố định enzyme GOD lên bề mặt vật liệu theo quy trình ở mục 2.1.3 và phản ứng được minh họa ở hình 3.7.
Phân tán 30 mg Fe3O4 – SiO2 – NH2 trong 6 ml dung dịch đệm phosphate (0,01M; pH=7,4) bằng cách rung siêu âm trong 10 phút; thêm 0,3 ml dung dịch glutaraldehyde (GA) 25% vào hỗn hợp và khuấy trong 6 giờ, các hạt nano được tách bằng nam châm và rửa với dung dịch đệm sau đó là nhiều lần với nước cất thu được các hạt Fe3O4 – SiO2 – NH2 – GA.
Lấy 7 ml enzyme glucose oxidase (0,5 mg/ml đệm phosphate pH=7,4) cho vào mẫu Fe3O4 – SiO2 – NH2 – GA đã chuẩn bị ở trên. Hỗn hợp các hạt nano-GOD được ủ ở nhiệt độ phòng 5 giờ thỉnh thoảng rung nhẹ. Dùng nam châm để tách các hạt nano gắn kết GOD (nano/GOD) ra khỏi hỗn hợp sau phản ứng. Các hạt nano Fe3O4 – SiO2 – GOD được rửa 3 lần với nước cất sau đó bảo quản ở 40C để làm các phân tích tiếp theo.
Dung dịch GOD sau khi gắn kết với các hạt nano được dùng để định lượng GOD còn thừa.
3.1.5. Kết quả định lượng hàm lượng enzyme glucose oxidase không gắn kết bằng phương pháp Bradford kết bằng phương pháp Bradford
Sự thay đổi màu sắc của 6 mẫu dung dịch GOD chuẩn khi phản ứng với thuốc thử Bradford thể hiện ở hình 3.8.
Hình 3.8. Màu của 6 mẫu dung dịch GOD chuẩn khi phản ứng với thuốc thử Bradford
Đo mật độ quang ở bước sóng 595 nm của 6 mẫu dung dịch GOD chuẩn và 1 mẫu dung dịch GOD sau gắn kết. Kết quả đo được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Giá trị mật độ quang đo tại bước sóng 595nm
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 (Mẫu)
[GOD] (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 ?
OD595nm 0,5421 0,5974 0,6371 0,6902 0,7540 0,8097 0,7879 OD595nm – ODĐC 0 0,0553 0,095 0,1481 0,2119 0,2676 0,2458
Từ giá trị mật độ quang của các mẫu dung dịch chuẩn, thiết lập sự phụ thuộc giữa mật độ quang và nồng độ như hình 3.9.
Hình 3.9. Đồ thị minh họa tương quan giữa mật độ quang và nồng độ GOD
Từ đồ thị, có phương trình đường chuẩn: y = 0,0053x – 0,0033; R2 = 0,9959 (1)
Nhận xét: Phương trình tuyến tính với hằng số tương quan cao R2 = 0,9959 nên có thể áp dụng để phân tích mẫu. Dựa vào phương trình (1) và giá trị đo mật độ quang của mẫu dung dịch GOD sau gắn kết là 0,2458 thay vào (1) tính được nồng độ enzyme còn thừa là 0,047 mg/ml. Hiệu suất gắn kết enzyme GOD:
H(%) = 𝐶𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚𝑒 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢 − 𝐶𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚𝑒 𝑑ư
𝐶𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚𝑒 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢 × 100% = 0,5 −0,047
0,5 × 100% = 90,6%
Vậy với 30 mg Fe3O4NP – SiO2 – NH2 thì cố định được 3,171 mg GOD.
3.2. ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA VẬT LIỆU 3.2.1. Nhiều xạ tia X (XRD) 3.2.1. Nhiều xạ tia X (XRD)
Phương pháp nhiễu xạ tia X để xác định cấu trúc tinh thể của Fe3O4NP và đánh giá sự ảnh hưởng của việc biến tính bề mặt và cố định enzyme trên Fe3O4NP đến cấu trúc tinh thể hạt nano oxit sắt từ. Các mẫu được đo trên thiết bị Diffractometer tại Khoa Hoá trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng.
y = 0.0053x - 0.0033 R² = 0.9959 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0 10 20 30 40 50 60
Giản đồ XRD của các hạt nano được trình bày ở hình 3.10.
Hình 3.10. Phổ nhiễu xạ tia X của Fe3O4 (a), Fe3O4 – SiO2 – NH2 (b), Fe3O4 – SiO2 – GOD (c)
Meas. data:Fe3O4-Nhan_Theta_2-Theta Magnetite, syn, Fe3 O4, 01-088-0315
Inte ns ity (cou nts ) 0 5000 10000 2-theta (deg) 10 20 30 40 50 60 70