5. Bố cục luận văn
2.1. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ VÀ HOÁ CHẤT
2.1.1. Nguyên liệu
Enzyme glucose oxidase từ Aspergillus niger được mua từ công ty Sigma – Aldrich.
Dung dịch glucose 10% được sản xuất bởi công ty dược phẩm B. Braun Hà Nội.
2.1.2. Dụng cụ và hóa chất
a. Dụng cụ và thiết bị
Các dụng cụ thủy tinh: bình cầu ba cổ, cốc, bình định mức, bình nón, pipet, burret,…
Hệ sinh hàn hồi lưu ba cổ, kết nối với hệ thống khí Ar để tạo môi trường trơ và hệ thống bơm điểu chỉnh tốc độ dòng chảy.
Máy khuấy từ gia nhiệt có cảm biến nhiệt độ.
Máy đo UV-Vis, kính hiển vi điện từ truyền quét – truyền qua,…
b. Hoá chất
Bảng 2.1. Các loại hoá chất chính sử dụng trong luận văn
STT Tên hoá chất Hãng sản xuất
1 3-Aminopropyl triethoxysilane (APTES) Merk
2 Dung dịch amoniac Trung Quốc
3 Ethanol USA
4 Glutaraldehyde Merk
5 NaH2PO4 Merk
6 Na2HPO4.12H2O Merk
7 Tetraethyl orthosilicates (TEOs) Merk
8 FeSO4.7H2O Merk
2.2. CHUẨN BỊ CÁC DUNG DỊCH 2.2.1. Dung dịch đệm phosphate 2.2.1. Dung dịch đệm phosphate
Cân 10,98 g Na2HPO4.12H2O và 2,319 g NaH2PO4 lần lượt cho vào 2 cốc và thêm một ít nước cất, khuấy đều cho tan hết, chuyển sang 2 bình định mức 250 ml, tráng kĩ đũa thủy tinh và cốc, thêm nước và định mức đến vạch.
Trộn 2 dung dịch vừa pha được dung dịch đệm phosphate có nồng độ 0,1M; pH=7,4. Kiểm tra độ chính xác bằng máy đo pH.
2.2.2. Dung dịch enzyme glucose oxidase
Cân 50 mg enzyme glucose oxidase cho vào cốc và thêm dung dịch đệm phosphate (0,1M; pH=7,4), khuấy đều đến khi tan hết, chuyển vào bình định mức 100 ml, tráng kĩ đũa thủy tinh và cốc, thêm dung dịch đệm và định mức tới vạch. Mẫu GOD (0,5 mg/ml) được bảo quản ở 40C và sử dụng trong 2 tuần.
2.2.3. Dung dịch glucose
Lấy V (ml) dung dịch glucose 10% đem pha loãng bằng dung dịch đệm phosphate (0,1M; pH=7,4) và định mức thành 100 ml ta được dung dịch glucose C%.
Bảng 2.2. Bảng pha dung dịch glucose
Dung dịch glucose 10% (ml) 10 20 30 40 50 60 70 80 Dung dịch đệm phosphate (ml) 90 80 70 60 50 40 30 20 Nồng độ glucose % 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8%
2.3. TỔNG HỢP NANO OXIT SẮT TỪ - SiO2 – GLUCOSO OXIDASE 2.3.1. Tổng hợp hạt nano oxit sắt từ (Fe3O4NP) 2.3.1. Tổng hợp hạt nano oxit sắt từ (Fe3O4NP)
Có nhiều phương pháp khác nhau để tổng hợp các hạt nano oxit sắt từ nhưng với mục tiêu thu được các hạt nhỏ, đồng nhất và thuận tiện, tiến hành điều chế các hạt Fe3O4NP bằng phương pháp đồng kết tủa theo mô tả ở hình 2.1.
Hoà tan FeSO4.7H2O và Fe2(SO4)3 (theo tỷ lệ mol 1 : 2) trong nước cất bằng máy khuấy từ trong môi trường Ar được dung dịch đồng nhất. Dung dịch NH3 (25- 28%) được thêm vào hỗn hợp dung dịch trên ở nhiệt độ phòng đến khi pH = 9 ÷ 11,
tăng nhiệt độ phản ứng lên 800C và khuấy trong môi trường Ar. Sau đó, để hỗn hợp dung dịch nguội đến nhiệt độ phòng, các hạt kết tủa được tách bằng nam châm và rửa nhiều lần bằng ethanol và nước cất [31].
Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp Fe3O4NP
2.3.2. Biến tính bề mặt Fe3O4NPs bằng oxit kim loại SiO2
Các hạt nano Fe3O4 có xu hướng không bền do sự tương tác từ trường lưỡng cực giữa các hạt. Để khắc phục nhược điểm này, sử dụng silic oxit để biến tính bề mặt Fe3O4NP với mục tiêu tăng độ ổn định của các hạt nano oxit sắt từ. Lớp phủ slica ngăn cản sự tiếp xúc trực tiếp giữa lõi từ tránh các tương tác không mong muốn; đóng vai trò như một tác nhân chống sự nung kết và biến đổi nhiệt tạo thành Fe2O3.
Chế tạo hạt coreshell có cấu trúc lõi vỏ Fe3O4 – SiO2 bằng phương pháp Stober. Quy trình tổng hợp được thể hiện ở hình 2.2.
Các hạt nano Fe3O4 được cho vào ethanol và nước cất, hỗn hợp được rung siêu âm trong để các hạt phân tán đều. Nhỏ từng giọt dung dịch NH4OH tiếp đến là
FeSO4.7H2O Fe2(SO4)3 Dung dịch Fe2+:Fe3+= 2:1 Hỗn hợp phản ứng Ar, khuấy từ Hỗn hợp sau phản ứng Tách bằng nam châm
Rửa bằng nước cất và ethanol
Fe3O4NP
Dung dịch NH3
800C, Ar, khuấy từ Ar, khuấy từ
TEOs vào hỗn hợp trên và khuấy cơ ở nhiệt độ phòng trong môi trường Ar. Kết thúc phản ứng, các hạt kết tủa được tách bằng nam châm sau đó rửa nhiều lần với ethanol và nước cất [7], [25], [31], [42], [48], [49], [50].
Hình 2.2. Sơ đồ tổng hợp Fe3O4 – SiO2
2.3.3. Chức năng hoá bề mặt Fe3O4 – SiO2 bằng APTES
Với mục đích hình thành nhóm chức –NH2 trên bề mặt các hạt coreshell Fe3O4 – SiO2, tiến hành chức năng hoá bề mặt Fe3O4 – SiO2 bằng APTES. Quy trình tổng hợp thể hiện ở hình 2.3.
Hình 2.3. Sơ đồ tổng hợp Fe3O4 – SiO2 – NH2
Các hạt nano Fe3O4 – SiO2 được phân tán trong ethanol bằng rung siêu âm. (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) được thêm nhanh vào hỗn hợp trên, khuấy cơ và gia nhiệt trong môi trường khí Ar. Sau đó, hỗn hợp dung dịch được
Fe3O4NP Ethanol + nước cất
1/ NH4OH 2/TEOs
Hỗn hợp sau khuấy
Tách bằng nam châm
Rửa bằng nước cất và ethanol Fe3O4 – SiO2
Ar, khuấy từ Ar, rung siêu âm
Fe3O4 – SiO2 Ethanol APTES Hỗn hợp sau khuấy Tách bằng nam châm Rửa bằng ethanol Fe3O4 – SiO2 – NH2 Ar, khuấy từ, t0C Ar, rung siêu âm
làm nguội đến nhiệt độ phòng. Các hạt Fe3O4 – SiO2 – NH2 được tách bằng nam châm và rửa nhiều lần bằng ethanol [12], [48], [49], [50].
2.3.4. Cố định enzyme glucose oxidase lên Fe3O4 – SiO2 – NH2
a. Tổng hợp Fe3O4 – SiO2 – Glucose oxidase
Để tiến hành cố định enzyme lên các hạt nano Fe3O4 – SiO2 – NH2, sử dụng phương pháp tạo liên kết chéo bằng glutaraldehyde (HOC-(CH2)3-CHO). Với 2 nhóm –CHO ở hai đầu, glutaradehyde tạo liên kết chặt chẽ giữa nhóm –NH2 của enzyme và nhóm –NH2 của Fe3O4 – SiO2 – NH2 làm giảm sự thất thoát lượng enzyme sau các quá trình sử dụng. Quy trình cố định được trình bày ở hình 2.4.
Hình 2.4. Sơ đồ tổng hợp Fe3O4 – SiO2 – GOD
Fe3O4 – SiO2 – NH2
Dung dịch GA 25%
Hỗn hợp sau khuấy
Tách bằng nam châm
Rửa bằng dung dịch đệm và nước cất Fe3O4 – SiO2 – NH2 – GA
GOD trong dung dịch đệm phosphate
Ar, rung siêu âm
Ar, khuấy từ Ủ, nhiệt độ phòng Hỗn hợp sau phản ứng Tách bằng nam châm Rửa bằng nước cất Fe3O4 – SiO2 – GOD Dung dịch đệm phosphate
Các hạt nano Fe3O4 – SiO2 – NH2 được phân tán trong dung dịch đệm phosphate bằng cách rung siêu âm, dung dịch glutaraldehyde (GA) 25% được thêm vào hỗn hợp dưới tác động của máy khuấy từ, các hạt nano được tách bằng nam châm và rửa với dung dịch đệm sau đó là nhiều lần với nước cất thu được các hạt Fe3O4 – SiO2 – NH2 – GA.
Lấy enzyme hòa tan trong dung dịch đệm phosphate cho vào mẫu Fe3O4 – SiO2 – NH2 – GA đã được điều chế trên. Hỗn hợp các hạt nano-GOD được ủ ở nhiệt độ phòng và thỉnh thoảng rung nhẹ. Sau đó các hạt nano được tách bởi nam châm và thu được các hạt nano gắn kết GOD (nano/GOD) và dung dịch GOD sau khi gắn kết với các hạt nano. Các hạt nano Fe3O4 – SiO2 – GOD được rửa 3 lần với nước cất sau đó bảo quản ở 40C để làm các phân tích tiếp theo, dung dịch GOD sau gắn kết được dùng để định lượng GOD còn lại [7], [25], [38].
b. Định lượng hàm lượng enzyme glucose oxidase không gắn kết bằng phương pháp Bradford
Để xác định lượng enzyme GOD đã được cố định lên Fe3O4 – SiO2 – NH2, tiến hành định lượng hàm lượng enzyme còn thừa bằng phương pháp Bradford.
Nguyên tắc: phương pháp này dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi
Coomassie Brilliant Blue G – 250 liên kết với protein trong dung dịch axit.
Trong môi trường acid mạnh, khi chưa kết hợp với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm, khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu bước sóng cực đại ở 595 nm.
Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một các trực tiếp tới nồng độ protein.
Tiến hành định lượng
- Chuẩn bị dãy enzyme GOD chuẩn có nồng độ tăng dần từ 0, 10, 20, 30, 40, 50 µg/ml.
- Lập một loạt 6 ống nhiệm theo số thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6 và một ống nghiệm thứ 7 chứa mẫu cần phân tích.
- Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút cho 3 ml thuốc thử vào ống nghiệm 1, lắc đều để yên. Ở thời điểm 1 phút cho 3 ml thuốc thử vào ống nghiệm 2, lắc đều để yên,… cứ tiếp tục cho đến hết.
Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ enzyme (µg/ml) với mật độ quang OD595nm.
Dựa vào phương trình tuyến tính giữa nồng độ enzyme (µg/ml) với mật độ quang OD595nm tính được hàm lượng enzyme còn thừa trong mẫu phân tích.
Bảng 2.3. Bảng pha nồng độ dung dịch chuẩn
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 GOD chuẩn (0,1mg/ml) (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Vnước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 [GOD] (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 TT Bradford (ml) 3 3 3 3 3 3
2.4. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC VẬT LIỆU 2.4.1. Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD) 2.4.1. Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD)
Nhiễu xạ tia X là một trong những phương pháp phổ biến nhất trong phân tích đặc trưng tính chất của vật liệu rắn (tinh thể và vô định hình) dùng để xác định cấu trúc, thành phần pha dựa trên số lượng, vị trí và cường độ các peak trên phổ để suy đoán kiểu mạng từ đó xác định bản chất của vật thể [1].
Fe3O4 là vật liệu từ tính cấu trúc tinh thể lập phương spinel. Vì vậy, để xác định cấu trúc tinh thể các hạt nano oxit sắt từ đã điều chế và xét sự ảnh hưởng của quá trình biến tính bề mặt, cố định enzyme trên Fe3O4 đến cấu trúc tinh thể Fe3O4
dùng phổ XRD để kiểm tra sự có mặt của các đỉnh nhiễu xạ đặc trưng: (220), (311), (222), (400), (442), (511) và (440).
Thực nghiệm: Trong luận văn này, giản đồ XRD được ghi trên thiết bị
và phần mền phân tích PDXL 2.4.2.0 với tia phát xạ CuK𝛼 có bước sóng 𝜆 = 1,5406 Å, công suất 40 KV, góc quét từ 10 đến 70 độ, nhiệt độ phòng, tốc độ quét 0,020/giây, thời gian một lần quét là 0,7 giây. Mẫu được nghiền mịn trước khi phân tích XRD.
2.4.2. Phương pháp quang phổ hồng ngoại (FT-IR)
Phương pháp phổ hồng ngoại dựa trên cơ sở của sự tương tác giữa chất cần phân tích với các tia đơn sắc có bước sóng nằm trong miền hồng ngoại (400-4000 cm-1) [5]. Mỗi cực đại trong phổ IR đặc trưng cho sự có mặt của một nhóm chức hoặc dao động của một liên kết. Do đó, có thể dựa vào các tần số đặc trưng này để dự đoán sự có mặt của các liên kết hoặc nhóm chức trong phân tử chất nghiên cứu.
Thực nghiệm: Trong luận văn, phổ IR dùng để chứng minh sự hình thành
các liên kết và nhóm chức khi biến tính bề mặt và cố định enzyme lên các hạt nano oxit sắt từ. Phổ IR của các mẫu vật liệu được thực hiện bởi kỹ thuật đo mẫu rắn bằng cách ép viên với KBr, các viên được tạo ra dưới lực ép khoảng 10.000 kg/m2. Phổ hồng ngoại được ghi trên máy Nicolet iS10 FT – IR, phần mềm OMNICTM
9.2.9 trong vùng bước sóng 400 đến 4000 cm-1.
2.4.3. Phương pháp kính hiển vi điện tử quét – truyền qua (SEM – TEM) TEM)
Phương pháp hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscopy, SEM) và hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscopy, TEM) đều sử dụng chùm tia điện tử để tạo ảnh mẫu nghiên cứu.
Phương pháp SEM được sử dụng để nghiên cứu bề mặt của vật liệu, phương pháp này cho biết các thông tin về hình thái của bề mặt và kích thước hạt. Trong khi đó, phương pháp TEM được sử dụng rất hiệu quả trong việc nghiên cứu đặc trưng bề mặt và cấu trúc của vật liệu.
Thực nghiệm: Kỹ thuật chuẩn bị mẫu để ghi ảnh hiển vi điện tử quét (SEM)
là phân tán mẫu vật liệu trên một màn mỏng. Mẫu được ghi ảnh trên máy S4800 – Hitachi. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu để ghi ảnh hiển vi điện tử truyền qua là các mẫu
được phân tán trong dung môi ethanol, sau đó cho lên trên các lưới bằng Cu. Hình ảnh TEM được ghi trên máy JEM1010 – JEOL.
2.4.4. Phương pháp phổ tán xạ năng lượng tia X (EDX)
Phương pháp phổ tán xạ năng lượng tia X (Energy Dispersive X-ray, EDX) là kỹ thuật phân tích thành phần hoá học của mẫu rắn dựa vào việc ghi lại phổ tia X phát ra từ mẫu do tương tác với chùm điện tử có năng lượng cao trong các kính hiển vi điện tử.
Về nguyên tắc, tất cả các nguyên tố có số hiệu nguyên tử từ 4 (Be) đến 92 (U) có thể phát hiện bằng phương pháp này, tuy nhiên không phải tất cả các thiết bị đều đo có thể đo được các nguyên tố nhẹ (Z<10).
Trong luận văn này, phổ EDX được ghi trên máy Emax – Horiba.
2.4.5. Phương pháp từ kế mẫu rung (VSM)
Từ kế mẫu rung (VSM) được phát minh bởi S. Fomer vào những năm 1950 và đang được dùng rất phổ biến. Đây là dụng cụ đo các tính chất từ của vật liệu, hoạt động trên nguyên tắc thu tín hiệu cảm ứng điện từ khi rung mẫu đo trong từ trường. Nó đo momen từ của mẫu cần đo trong từ trường ngoài.
Thực nghiệm: Đường cong từ kế mẫu rung (VSM) được thực hiện tại Trung
tâm đánh giá hư hỏng vật liệu – Viện Khoa học Vật liệu.
2.4.6. Phương pháp phân tích nhiệt DTA/TG
Nguyên tắc: Phân tích nhiệt là nhóm phương pháp theo dõi sự thay đổi tính
chất của vật liệu (mẫu đo) theo sự thay đổi nhiệt độ. Khi cung cấp nhiệt năng thì làm cho nhiệt độ của mẫu tăng lên một giá trị xác định tuỳ thuộc vào nhiệt lượng cung cấp và nhiệt lượng của mẫu. Ở trạng thái vật lý bình thường nhiệt độ của mẫu biến đổi chậm theo nhiệt lượng, nhưng khi có sự chuyển pha (bay hơi, nóng chảy,...) thì sự biến đổi này bị gián đoạn hoặc thay đổi đột ngột. Các quá trình biến đổi này có thể ghi nhận bằng phương pháp phân tích nhiệt.
Phép phân tích nhiệt bao gồm nhiều phương pháp khác nhau. Trong luận văn này, sử dụng phương pháp TG (Thermogravimetry) để đo sự biến đổi khối lượng khi gia nhiệt và phép phân tích nhiệt vi sai quét (Diferential Thermal Analysis, DTA) xác định sự biến đổi của nhiệt lượng truyền qua mẫu.
Thực nghiệm: Trong luận văn này, phương pháp phân tích nhiệt TG – DTA được dùng để xác định sự có mặt của các vật liệu có trên bề mặt của các hạt nano oxit sắt từ nhờ sự biến đổi của vật liệu theo nhiệt độ và hiện tượng mất khối lượng của vật liệu. Các mẫu được đo trong dòng khí trơ N2 từ nhiệt độ phòng đến 8000C với tốc độ gia nhiệt 100C/phút. Thông số của máy phân tích TGA: hệ phân tích nhiệt trọng trường TGA/DSC STA 6000 của hãng Perkin Elmer.
2.5. NGHIÊN CỨU PHẢN ỨNG OXY HÓA GLUCOSO BẰNG HỆ XÚC TÁC Fe3O4 – SiO2 – GOD TÁC Fe3O4 – SiO2 – GOD
2.5.1. Phản ứng oxy hóa glucose bằng hệ xúc tác Fe3O4 – SiO2 – GOD
Glucose oxidase là enzyme xúc tác cho quá trình oxy hoá dung dịch β – D – glucose. Vì vậy để kiểm tra sự gắn kết và đánh giá hoạt tính xúc tác của enzyme sau khi cố định lên chất mang. Tiến hành thực hiện phản ứng oxy hoá glucose bằng hệ xúc tác Fe3O4 – SiO2 – GOD theo sơ đồ hình 2.5.
Hình 2.5. Sơ đồ phản ứng oxy hoá glucose bằng hệ xúc tác Fe3O4 – SiO2 – GOD
Kết thúc phản ứng, để đánh giá hoạt tính xúc tác của enzyme cố định, dùng dung dịch iod để định lượng dung dịch glucose còn thừa sau phản ứng xúc tác bằng phương pháp chuẩn độ ngược.
+ Nguyên tắc phương pháp:
Phương pháp chuẩn độ ngược để định lượng dung dịch glucose như sau: cho một thể tích chính xác dung dịch glucose cần định lượng tác dụng với một thể tích chính xác và dư dung dịch iod. Sau đó dùng dung dịch chuẩn độ natri thiosulfat để định lượng iod thừa:
- Dùng 1 thể tích chính xác và quá dư dung dịch I2 0,1N cho tác dụng với dung dịch glucose, trong môi trường kiềm để oxy hóa triệt để glucose.
20 ml dung dịch glucose C%
0,5g Fe3O4 – SiO2 – GOD Nhiệt độ, thời gian, pH Sản phẩm phản ứng
Đầu tiên Iod sẽ phản ứng với NaOH theo phản ứng sau: