5. Bố cục luận văn
2.3.4. Cố định enzyme glucose oxidase lên Fe3O4 –SiO2 –NH2
a. Tổng hợp Fe3O4 – SiO2 – Glucose oxidase
Để tiến hành cố định enzyme lên các hạt nano Fe3O4 – SiO2 – NH2, sử dụng phương pháp tạo liên kết chéo bằng glutaraldehyde (HOC-(CH2)3-CHO). Với 2 nhóm –CHO ở hai đầu, glutaradehyde tạo liên kết chặt chẽ giữa nhóm –NH2 của enzyme và nhóm –NH2 của Fe3O4 – SiO2 – NH2 làm giảm sự thất thoát lượng enzyme sau các quá trình sử dụng. Quy trình cố định được trình bày ở hình 2.4.
Hình 2.4. Sơ đồ tổng hợp Fe3O4 – SiO2 – GOD
Fe3O4 – SiO2 – NH2
Dung dịch GA 25%
Hỗn hợp sau khuấy
Tách bằng nam châm
Rửa bằng dung dịch đệm và nước cất Fe3O4 – SiO2 – NH2 – GA
GOD trong dung dịch đệm phosphate
Ar, rung siêu âm
Ar, khuấy từ Ủ, nhiệt độ phòng Hỗn hợp sau phản ứng Tách bằng nam châm Rửa bằng nước cất Fe3O4 – SiO2 – GOD Dung dịch đệm phosphate
Các hạt nano Fe3O4 – SiO2 – NH2 được phân tán trong dung dịch đệm phosphate bằng cách rung siêu âm, dung dịch glutaraldehyde (GA) 25% được thêm vào hỗn hợp dưới tác động của máy khuấy từ, các hạt nano được tách bằng nam châm và rửa với dung dịch đệm sau đó là nhiều lần với nước cất thu được các hạt Fe3O4 – SiO2 – NH2 – GA.
Lấy enzyme hòa tan trong dung dịch đệm phosphate cho vào mẫu Fe3O4 – SiO2 – NH2 – GA đã được điều chế trên. Hỗn hợp các hạt nano-GOD được ủ ở nhiệt độ phòng và thỉnh thoảng rung nhẹ. Sau đó các hạt nano được tách bởi nam châm và thu được các hạt nano gắn kết GOD (nano/GOD) và dung dịch GOD sau khi gắn kết với các hạt nano. Các hạt nano Fe3O4 – SiO2 – GOD được rửa 3 lần với nước cất sau đó bảo quản ở 40C để làm các phân tích tiếp theo, dung dịch GOD sau gắn kết được dùng để định lượng GOD còn lại [7], [25], [38].
b. Định lượng hàm lượng enzyme glucose oxidase không gắn kết bằng phương pháp Bradford
Để xác định lượng enzyme GOD đã được cố định lên Fe3O4 – SiO2 – NH2, tiến hành định lượng hàm lượng enzyme còn thừa bằng phương pháp Bradford.
Nguyên tắc: phương pháp này dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi
Coomassie Brilliant Blue G – 250 liên kết với protein trong dung dịch axit.
Trong môi trường acid mạnh, khi chưa kết hợp với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm, khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu bước sóng cực đại ở 595 nm.
Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một các trực tiếp tới nồng độ protein.
Tiến hành định lượng
- Chuẩn bị dãy enzyme GOD chuẩn có nồng độ tăng dần từ 0, 10, 20, 30, 40, 50 µg/ml.
- Lập một loạt 6 ống nhiệm theo số thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6 và một ống nghiệm thứ 7 chứa mẫu cần phân tích.
- Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút cho 3 ml thuốc thử vào ống nghiệm 1, lắc đều để yên. Ở thời điểm 1 phút cho 3 ml thuốc thử vào ống nghiệm 2, lắc đều để yên,… cứ tiếp tục cho đến hết.
Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ enzyme (µg/ml) với mật độ quang OD595nm.
Dựa vào phương trình tuyến tính giữa nồng độ enzyme (µg/ml) với mật độ quang OD595nm tính được hàm lượng enzyme còn thừa trong mẫu phân tích.
Bảng 2.3. Bảng pha nồng độ dung dịch chuẩn
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 GOD chuẩn (0,1mg/ml) (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Vnước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 [GOD] (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 TT Bradford (ml) 3 3 3 3 3 3
2.4. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC VẬT LIỆU 2.4.1. Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD)