5. Bố cục luận văn
1.3.6.Cố định enzyme lên các hạt nano oxit sắt từ
Như đã trình bày ở mục 1.1.2, MNPs có tính đặc hiệu so với các vật liệu khác. Thứ nhất, tính tương thích sinh học của hạt nano với enzyme là điều kiện tiên quyết cho sự cố định enzyme, đảm bảo hiệu quả kết dính, độ bền và hoạt tính của chế phẩm enzyme. Thứ hai, diện tích bề mặt của MNPs lớn làm tăng cường khả năng chất chứa enzyme và cải thiện khả năng tương tác giữa enzyme và cơ chất. Thứ ba, MNPs sau khi được biến tính bề mặt có thể hoà tan trong nước, tương thích sinh học tốt và có nhiều nhóm chức, thông qua các nhóm chức năng, hạt từ có thể liên kết đồng hoá trị với nhiều loại enzyme khác nhau. Thứ tư, các hạt có kích thước nhỏ dẫn đến độ phân tán cao, do đó làm giảm sự thất thoát enzyme và tăng sự tiếp xúc của enzyme với cơ chất. Thứ năm, tính ổn định MNPs có thể cải thiện bằng cách tạo một lớp phủ phù hợp trên bề mặt. Cuối cùng, tính chất siêu thuận từ của cho phép tách các enzyme được cố định bằng từ trường ngoài và tái sử dụng [40].
a. Tính ổn định và hoạt động của enzyme cố định
Để sử dụng các enzyme cố định cho các ứng dụng trong công nghiệp, sự ổn định và hoạt động của enzyme rất cần thiết. Hai yếu tố này chịu ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố môi trường và phương pháp cố định enzyme lên chất mang. Sau khi cố định enzyme trên MNP, sự ổn định của enzyme thường tăng lên khi thay đổi pH, nhiệt độ và dung môi hữu cơ. Tuy nhiên, sau khi cố định thì hoạt động của enzyme luôn giảm bởi sự liên kết amide ngẫu nhiên hoặc hình thành phức Base Schiff [18].
Yang và các đồng nghiệp đã sử dụng phương pháp bọc enzyme bằng MNP để giải quyết vấn đề này [45]. Glucose oxidase được bọc trong các nang tạo bởi poly (pyrrole – N – propylsulfonic) gắn trên bề mặt các hạt nano oxit sắt. Các hạt
nano được giữ trong nang hoạt động tốt hơn so với enzyme tự do dưới sự thay đổi pH, dung môi hữu cơ và nhiệt độ cao.
Đặc tính vị trí cũng được coi là một phương pháp hiệu quả để duy trì hoạt động của enzyme. Yu và các đồng nghiệp báo cáo rằng CMP – sialic acid synthetase đã được cố định trên các hạt MNP đã được chức năng hoá nhờ cystein thu được bằng quá trình sol – gel, mang lại đặc tính tuyệt vời cho enzyme [46].
Sự ổn định của hệ thống xúc tác khá quan trọng. Thứ nhất, sự ổn định của hệ thống xúc tác có thể được đánh giá trên các hạt chất mang ban đầu, các hạt oxit sắt từ sau khi tổng hợp có xu hướng kết dính với nhau vì vậy cần phủ một lớp bảo vệ. Enzyme cố định trên các hạt oxit sắt trần có thể kết hợp với nhau trong quá trình tách từ và phân tán, dẫn đến giảm sự tiếp cận của enzyme với cơ chất. Rose và cộng sự đã biến đổi bề mặt MNPs bằng ammonium để làm cho hoạt động của glucose oxidase không thay đổi [35]. Tuy nhiên, hệ thống này đã giảm 50% so với hoạt động ban đầu sau 5 lần thực hiện phản ứng. Hơn nữa, các MNP được bọc bằng silica có nhóm chức năng – NH2 để gắn kết enzyme. Silica như một lớp bảo vệ để tránh sự gắn kết của các hạt oxit sắt và giúp tăng độ ổn định của hệ xúc tác, nhưng sự ổn định thu được không đủ để phục hồi và tái sử dụng chất xúc tác hiệu quả. Gao và cộng sự báo cáo công trình nghiên cứu chỉ cho thấy kết quả sau một lần tái sử dụng trong các vật liệu làm cơ chất mà không cung cấp dữ liệu chi tiết nào cho các lần tái sử dụng tiếp theo [20]. Tương tự, Lee và cộng sự cho thấy khi cố định lipase trên sillica MNPs bằng liên kết đồng hoá trị thì hoạt động của E sẽ giảm trong quá trình tái sử dụng. Sau 10 chu kỳ, hoạt động cuối cùng cũng chỉ đạt 60% so với ban đầu [6].
Thứ hai, sự ổn định lâu dài của hệ thống xúc tác cũng có thể được đánh giá theo phương pháp cố định. Có 3 phương pháp thường được sử dụng ở hiện tại là liên kết cộng hoá trị, hấp phụ và giữ enzyme trong gel. Liên kết cộng hoá trị tạo sự gắn kết chặt chẽ giữa enzyme và MNPs. Ngược lại, trong quá trình hấp phụ, lực Van der Walls hoặc các tương tác kị nước là lực chính để gắn kết enzyme. Enzyme có thể bị rửa trôi trong quá trình sử dụng lặp lại nhiều lần và trong các điều kiện
khắc nghiệt. Lee và cộng sự đã cho thấy hấp phụ lipase trên các hạt MNPs thì sự gắn kết này không bền vững. Khi tái sử dụng lần đầu, hiệu suất đã giảm gần một nửa. Họ cho rằng các lipase đã bị thất thoát trong phản ứng đầu tiên [31].
b. Các enzyme cố định trên MNPs có thể được tách bằng từ trường ngoài
Một tính năng độc đáo của các enzyme cố định trên MNPs đó là có thể dễ dàng tách loại bằng cách sử dụng từ trường ngoài. Để có được hiệu quả tách tốt thì các hạt phải không có từ dư. Lee và cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp các hạt MNP siêu thuận từ bằng phương pháp micelle đảo. Các hạt có hình dạng đồng nhất bao phủ bởi lớp vỏ sillica. MNPs có kích thước 12 nm, dễ dàng tách bằng một nam châm vĩnh cửu [31].
c. Độ phân tán
Độ phân tán cao làm giảm thiểu giới hạn chuyển đổi khối lượng. Hong và cộng sự đã tổng hợp các MNPs bảo phủ bởi polymer hydrophilic. Polymer này thu được bằng phương pháp quang hoá. Lee chứng minh tính ưa nước khi phân tán tốt trong nước và sự kết hợp trong hexane [36].
d. Chức năng đa dạng
Nhóm chức năng trên bề mặt MNPs có thể được đa dạng hoá. Có rất nhiều báo cáo về việc chức năng hoá bề mặt MNPs bằng các amine [31], [46]. Việc sử dụng nhóm chelating cũng là một kỹ thuật phổ biến [18].
1.3.7. Tình hình nghiên cứu việc cố định enzyme trên Fe3O4NP
Wang và cộng sự công bố nghiên cứu đề tài cố định enzyme glucose oxidase (GOD) trên CoFe2O4/SiO2 NPs thông qua liên kết chéo hóa glutaraldehyde. Sau khi cố định, GOD có sự cải thiện về độ bền nhiệt, có thể lưu trữ trong thời gian dài hơn mà hoạt tính của enzyme không bị mất đi. Enzyme GOD sau khi cố định vẫn duy trì được 80% hoạt tính ban đầu. Sau khi lưu giữ ở 40C trong 28 ngày, hoạt tính của enzyme cố định và enzyme tự do vẫn còn 87% và 40% hoạt tính ban đầu [38].
Yang và cộng sự đã cố định enzyme glucose oxidase bằng cách bọc trong các nang tạo bởi poly (pyrrole – N – propylsulfonic) gắn trên bề mặt các hạt nano oxit sắt. Các hạt nano được giữ trong nang hoạt động tốt hơn so với enzyme tự do
dưới sự thay đổi pH, dung môi hữu cơ và nhiệt độ cao [45]. Tương tự, Y. Yang và cộng sự đã bọc GOD trên Fe3O4-C-SiO2 tạo thành vật liệu composite GOD có khả năng xúc tác tương đối ổn định trong khoảng nhiệt độ 250C đến 650C, ngay cả sau 4 giờ ủ ở 550C, hoạt tính của enzyme vẫn giữ lại được 77% so với ban đầu, trong khi các enzyme tự do chỉ giữ lại được 30%. Bên cạnh đó, vật liệu cũng cho thấy khả năng tái sử dụng tuyệt vời [44].
Huang và cộng sự thực hiện cố định enzyme glucose oxidase trên các hạt nano từ Fe3O4 – SiO2 bằng glutaraldehyde. Hoạt tính của GOD cố định là 4,570 U/g ở pH = 7 và 500C. GOD cố định giữ lại 80% hoạt tính ban đầu của nó sau 6 giờ ở 450C trong khi enzyme tự do chỉ giữ lại 20%. Các GOD cố định duy trì 60% hoạt tính ban đầu của nó sau 6 chu kỳ sự dụng lặp đi lặp lại và giữ lại 75% hoạt tính ban đầu của nó sau 1 tháng ở 40C trong khi enzyme tự do giữ lại 62% hoạt tính của nó [25].
Kuo và cộng sự báo cáo các hạt nano Fe3O4 – chitosan được sử dụng để cố định lipase với tác nhân gắn kết là N – (3-dimetylaminopropyl) – N’ – ethylcarbodiimide (EDC) và N – hydroxysuccinimide (NHS); điều kiện tối ưu để cố định được xác định như sau: thời gian cố định 2,14 giờ, pH = 6,37, tỉ lệ về khối lượng giữa enzyme/chất mang = 0,73; hoạt tính cao nhất nhận được là 20 U/g Fe3O4 – chitosan. Enzyme cố định lipase duy trì được hơn 83% hoạt tính ban đầu của nó sau 20 chu kỳ xúc tác [30].
Lee và cộng sự cho thấy khi cố định lipase trên sillica MNPs bằng liên kết đồng hoá trị thì hoạt động của enzyme sẽ giảm trong quá trình tái sử dụng. Sau 10 chu kỳ, hoạt động cuối cùng cũng chỉ đạt 60% so với ban đầu [31].
1.4. XÚC TÁC SINH HỌC NANO
Xúc tác sinh học là một công nghệ quan trọng để tổng hợp hoá chất, dược phẩm cũng như các thành phần thực phẩm và hoá chất nông nghiệp [37]. Tế bào vi sinh gồm tế bào động vật và tế bào thực vật cũng như các enzyme thường được áp dụng cho quá trình tổng hợp. So với xúc tác hoá học, bằng cách sử dụng vật liệu hữu cơ – kim loại hoặc phối tử kim loại, lợi thế của xúc tác sinh học hiển nhiên: có
đặc thù lập thể và sự chọn lọc đối quang với hiệu suất sản xuất tốt, hoạt tính xúc tác và tần suất quay vòng cao trong điều kiện phản ứng nhẹ nhàng [37]. Trong những năm gần đây, lấy cảm hứng từ sự phát triển nhanh chóng của công nghệ sinh học nano, xúc tác sinh học có thể tạo ra những khả năng mới để đạt được kết quả tốt nhất [39].
Xúc tác sinh học nano bao gồm ba khía cạnh: nano, sinh học và xúc tác. Từ “nano” có nghĩa yêu cầu kích thước của hệ thống xúc tác liên quan đến đặc tính bề mặt đặc biệt của vật liệu nano. Nói chung, công nghệ sinh học nano mô tả các enzyme được gắn kết trên các giá thể nano hoặc bọc trong cấu trúc nano thực hiện quá trình chuyển hoá sinh học và xúc tác [40].
So với những giá thể (support) truyền thống, những kì vọng mang lại khi sử dụng vật liệu nano mới này là điều hiển nhiên. Thứ nhất, enzyme cố định trên cấu trúc nano nên ổn định trong điều kiện khắc nghiệt như trong dung môi hữu cơ, pH và nhiệt độ cao. Thứ hai, enzyme cố định có thể dễ dàng tách ra khỏi hỗn hợp phản ứng chứa chất thải rắn và lỏng để làm sạch sản phẩm. Thứ ba, hạn chế chuyển giao khối lượng giữa bề mặt và sản phẩm nên tăng năng suất sản xuất. Thứ tư, enzyme cố định duy trì được hoạt tính xúc tác của nó khi được gắn kết vào các giá thể nano. Thứ năm, các enzyme thường đắt và hiếm nên được tái sử dụng và tái chế để giảm chi phí cho lợi ích kinh tế cao hơn [40].
CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ VÀ HOÁ CHẤT 2.1.1. Nguyên liệu 2.1.1. Nguyên liệu
Enzyme glucose oxidase từ Aspergillus niger được mua từ công ty Sigma – Aldrich.
Dung dịch glucose 10% được sản xuất bởi công ty dược phẩm B. Braun Hà Nội.
2.1.2. Dụng cụ và hóa chất
a. Dụng cụ và thiết bị
Các dụng cụ thủy tinh: bình cầu ba cổ, cốc, bình định mức, bình nón, pipet, burret,…
Hệ sinh hàn hồi lưu ba cổ, kết nối với hệ thống khí Ar để tạo môi trường trơ và hệ thống bơm điểu chỉnh tốc độ dòng chảy.
Máy khuấy từ gia nhiệt có cảm biến nhiệt độ.
Máy đo UV-Vis, kính hiển vi điện từ truyền quét – truyền qua,…
b. Hoá chất
Bảng 2.1. Các loại hoá chất chính sử dụng trong luận văn
STT Tên hoá chất Hãng sản xuất
1 3-Aminopropyl triethoxysilane (APTES) Merk
2 Dung dịch amoniac Trung Quốc
3 Ethanol USA
4 Glutaraldehyde Merk
5 NaH2PO4 Merk
6 Na2HPO4.12H2O Merk
7 Tetraethyl orthosilicates (TEOs) Merk
8 FeSO4.7H2O Merk
2.2. CHUẨN BỊ CÁC DUNG DỊCH 2.2.1. Dung dịch đệm phosphate 2.2.1. Dung dịch đệm phosphate
Cân 10,98 g Na2HPO4.12H2O và 2,319 g NaH2PO4 lần lượt cho vào 2 cốc và thêm một ít nước cất, khuấy đều cho tan hết, chuyển sang 2 bình định mức 250 ml, tráng kĩ đũa thủy tinh và cốc, thêm nước và định mức đến vạch.
Trộn 2 dung dịch vừa pha được dung dịch đệm phosphate có nồng độ 0,1M; pH=7,4. Kiểm tra độ chính xác bằng máy đo pH.
2.2.2. Dung dịch enzyme glucose oxidase
Cân 50 mg enzyme glucose oxidase cho vào cốc và thêm dung dịch đệm phosphate (0,1M; pH=7,4), khuấy đều đến khi tan hết, chuyển vào bình định mức 100 ml, tráng kĩ đũa thủy tinh và cốc, thêm dung dịch đệm và định mức tới vạch. Mẫu GOD (0,5 mg/ml) được bảo quản ở 40C và sử dụng trong 2 tuần.
2.2.3. Dung dịch glucose
Lấy V (ml) dung dịch glucose 10% đem pha loãng bằng dung dịch đệm phosphate (0,1M; pH=7,4) và định mức thành 100 ml ta được dung dịch glucose C%.
Bảng 2.2. Bảng pha dung dịch glucose
Dung dịch glucose 10% (ml) 10 20 30 40 50 60 70 80 Dung dịch đệm phosphate (ml) 90 80 70 60 50 40 30 20 Nồng độ glucose % 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8%
2.3. TỔNG HỢP NANO OXIT SẮT TỪ - SiO2 – GLUCOSO OXIDASE 2.3.1. Tổng hợp hạt nano oxit sắt từ (Fe3O4NP) 2.3.1. Tổng hợp hạt nano oxit sắt từ (Fe3O4NP)
Có nhiều phương pháp khác nhau để tổng hợp các hạt nano oxit sắt từ nhưng với mục tiêu thu được các hạt nhỏ, đồng nhất và thuận tiện, tiến hành điều chế các hạt Fe3O4NP bằng phương pháp đồng kết tủa theo mô tả ở hình 2.1.
Hoà tan FeSO4.7H2O và Fe2(SO4)3 (theo tỷ lệ mol 1 : 2) trong nước cất bằng máy khuấy từ trong môi trường Ar được dung dịch đồng nhất. Dung dịch NH3 (25- 28%) được thêm vào hỗn hợp dung dịch trên ở nhiệt độ phòng đến khi pH = 9 ÷ 11,
tăng nhiệt độ phản ứng lên 800C và khuấy trong môi trường Ar. Sau đó, để hỗn hợp dung dịch nguội đến nhiệt độ phòng, các hạt kết tủa được tách bằng nam châm và rửa nhiều lần bằng ethanol và nước cất [31].
Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp Fe3O4NP
2.3.2. Biến tính bề mặt Fe3O4NPs bằng oxit kim loại SiO2
Các hạt nano Fe3O4 có xu hướng không bền do sự tương tác từ trường lưỡng cực giữa các hạt. Để khắc phục nhược điểm này, sử dụng silic oxit để biến tính bề mặt Fe3O4NP với mục tiêu tăng độ ổn định của các hạt nano oxit sắt từ. Lớp phủ slica ngăn cản sự tiếp xúc trực tiếp giữa lõi từ tránh các tương tác không mong muốn; đóng vai trò như một tác nhân chống sự nung kết và biến đổi nhiệt tạo thành Fe2O3.
Chế tạo hạt coreshell có cấu trúc lõi vỏ Fe3O4 – SiO2 bằng phương pháp Stober. Quy trình tổng hợp được thể hiện ở hình 2.2.
Các hạt nano Fe3O4 được cho vào ethanol và nước cất, hỗn hợp được rung siêu âm trong để các hạt phân tán đều. Nhỏ từng giọt dung dịch NH4OH tiếp đến là
FeSO4.7H2O Fe2(SO4)3 Dung dịch Fe2+:Fe3+= 2:1 Hỗn hợp phản ứng Ar, khuấy từ Hỗn hợp sau phản ứng Tách bằng nam châm
Rửa bằng nước cất và ethanol
Fe3O4NP
Dung dịch NH3
800C, Ar, khuấy từ Ar, khuấy từ
TEOs vào hỗn hợp trên và khuấy cơ ở nhiệt độ phòng trong môi trường Ar. Kết thúc phản ứng, các hạt kết tủa được tách bằng nam châm sau đó rửa nhiều lần với ethanol và nước cất [7], [25], [31], [42], [48], [49], [50].
Hình 2.2. Sơ đồ tổng hợp Fe3O4 – SiO2
2.3.3. Chức năng hoá bề mặt Fe3O4 – SiO2 bằng APTES
Với mục đích hình thành nhóm chức –NH2 trên bề mặt các hạt coreshell Fe3O4 – SiO2, tiến hành chức năng hoá bề mặt Fe3O4 – SiO2 bằng APTES. Quy trình tổng hợp thể hiện ở hình 2.3.
Hình 2.3. Sơ đồ tổng hợp Fe3O4 – SiO2 – NH2
Các hạt nano Fe3O4 – SiO2 được phân tán trong ethanol bằng rung siêu âm. (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) được thêm nhanh vào hỗn hợp trên, khuấy cơ và gia nhiệt trong môi trường khí Ar. Sau đó, hỗn hợp dung dịch được
Fe3O4NP Ethanol + nước cất
1/ NH4OH 2/TEOs
Hỗn hợp sau khuấy
Tách bằng nam châm
Rửa bằng nước cất và ethanol Fe3O4 – SiO2
Ar, khuấy từ Ar, rung siêu âm
Fe3O4 – SiO2 Ethanol APTES Hỗn hợp sau khuấy Tách bằng nam châm