5. Bố cục luận văn
1.3.4. Phương pháp cố định enzyme
a. Phương pháp hấp phụ
Enzyme được gắn với giá thể bằng cách hấp phụ vât lý trên bề mặt giá thể (hình 1.15). Phương pháp này dễ thực hiện nhất và thường ít ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme. Tuy nhiên, enzyme cũng dễ bị rửa trôi trong quá trình sử dụng lặp lại nhiều lần. Mức độ giữ enzyme trên chất mang, phụ thuộc nhiều vào pH, lực ion. Khi muốn tách enzyme ra khỏi chất mang có thể sử dụng dung dịch có lực ion lớn [22]. Các giá thể được dùng để hấp phụ có dung tích hấp phụ lớn như:
- Cellulose và các dẫn xuất của nó như diethylaminoethyl hoặc carboxymethyl (CM) cellulose [22].
- Dextran và các dẫn xuất dextran: DEAE- và CM-dextran [22]. - Hydroxyllapatile, calcium phosphate [22].
b. Bọc enzyme trong các nang
Phương pháp bọc enzyme trong nang (hình 1.16) thực hiện bằng cách bao bọc các enzyme trong màng bán thấm, tương tự như giữ enzyme trong gel, nhưng bị hạn chế trong không gian. Các protein hoặc enzyme lớn không thể thoát ra, hoặc vào trong viên nang, nhưng các cơ chất và sản phẩm nhỏ có thể đi qua màng [22].
Những vật liệu đã được sử dụng để chế tạo các viên nang có đường kính từ 10 - 100 𝜇m như nylon và cellulose nitrate. Ionotropic gelation của alginates đã chứng minh nó có hiệu quả trong việc bọc các loại thuốc, enzyme và tế bào [22].
Hình 1.16. Bọc enzyme trong các nang [22] c. Giữ enzyme trong gel
Sự cố định bằng cách nhốt enzyme trong gel khác với phương pháp hấp phụ và liên kết cộng hoá trị là enzyme không kết hợp trực tiếp vào giá thể hay chất mang, mà có thể hình dung như là enzyme bị bẫy trong các mắt lưới của lưới (hình 1.17), nên cấu trúc của enzyme không bị biến đổi nhiều. Kích thước của lưới gel được kiểm soát để đảm bảo cấu trúc này đủ bé để ngăn chặn enzyme thoát ra ngoài khi sử dụng, nhưng cũng phải đủ lớn để cơ chất có thể khuếch tán vào đến enzyme và sản phẩm được tạo thành có thể khuếch tán ra khỏi mắt lưới [22].
Các chất có thể tạo gel trong phương pháp này là các chất có cấu tạo mắt lưới như: gelatin, alginate, agarose, polyacryaminde hoặc các polymer tổng hợp.
Hình 1.17. Giữ enzyme trong gel [22]
d. Tạo liên kết chéo giữa các phân tử enzyme
Phương pháp này hoàn toàn không dùng chất mang, mà thường dùng các chất có nhóm chức năng kép, có 2 nhóm chức ở hai đầu hoàn toàn giống nhau, phản ứng với các nhóm chức của các phân tử enzyme khác nhau, tạo ra các liên kết chéo giữa chúng, “khâu” các phân tử enzyme lại với nhau thành các phân tử có kích thước lớn hơn, không tan, có thể tách khỏi dung dịch bằng cách ly tâm hoặc lọc [22].
Các chất thường được dùng vào mục đích này là glutaraldehyde và một số chất khác như dimethylsuberimidate, phản ứng với nhóm amine; hoặc một số chất phản ứng với nhóm carboxyl, nhóm thiol, trong đó glutaraldehyde được dùng phổ biến nhất [22]. Phương pháp tạo liên kết chéo giữa các phân tử enzyme được mô tả ở hình 3.18.
Hình 1.18. Tạo liên kết chéo giữa các enzyme [22]
e. Gắn enzyme vào chất mang rắn bằng liên kết cộng hoá trị
Phương pháp cố định này liên quan đến sự hình thành liên kết cộng hoá trị giữa enzyme và chất mang như ở hình 1.19. Các liên kết cộng hoá trị sẽ tạo liên kết
chặt giữa enzyme với chất mang so với các phương pháp cố định khác vì vậy có thể làm giảm sự thất thoát lượng enzyme sau các quá trình xúc tác [22].
Các liên kết cộng hoá trị được hình thành giữa các nhóm chức trên bề mặt chất mang và các nhóm chức của enzyme (các nhóm amin, carboxyl và cả nhóm thiol) [22].
Hình 1.19. Cố định enzyme bằng liên kết cộng hoá trị [22]
Bảng 1.2. Các phương pháp cố định enzyme lên chất mang bằng liên kết cộng hoá trị [22]
Gắn enzyme vào chất mang bằng liên kết cộng trị thường qua 2 giai đoạn chính:
- Xử lý, hoạt hoá chất mang trước khi gắn enzyme. - Gắn enzyme vào chất mang đã được hoạt hoá.
Một số phương pháp thường được dùng để hoạt hoá chất mang như: dùng cyanogen, bromide, diazot hoá, azide acid, các chất ngưng tụ,... được thể hiện ở bảng 1.2.
Phản ứng Liên kết giữa enzyme và chất mang Diazot hoá Giá thể --N=N---enzyme Ankyl hoá và acryl hoá
Giá thể--CH2-NH---enzyme Giá thể--CH2-S---enzyme Hình thành phức Schiff's base Giá thể--CH=CN---enzyme
Tạo liên kết peptide Giá thể--CO-NH---enzyme Phản ứng amide Giá thể--CNH-NH---enzyme