3.2.1.1. Khảo sát các điều kiện hệ thống HPLC
Chọn điều kiện bơm mẫu
Với hệ thống HPLC – MS/MS 6410MS (Agilent), bộ phận bơm mẫu là tự động (Auto Sampler). Mẫu đã chuẩn bị nạp vào ống 2ml đặt trong khay, sau đó cánh tay roboot sẽ hút chính xác và nạp mẫu vào vòng mẫu bằng 1 xi lanh ở áp suất cao, sau nhờ hệ thống chuyển van mà mẫu đƣợc dòng pha động nạp vào cột tách.
Để phù hợp cấu hình máy và đạt đƣợc yêu cầu về độ chính xác, độ lặp lại của thiết bị, chúng tôi chọn thể tích bơm mẫu là 20 µl vì khi đó sai số nằm trong giới hạn kiểm soát (theo nhà sản xuất ), không ảnh hƣởng đến thành phần dung môi pha động. Lƣợng cơ
52
chất thực vật và HCBVTV trong mẫu vẫn nằm trong giới hạn cho phép đối với khả năng phân giải của cột tách (theo phƣơng pháp tách chiết ).
Toàn bộ các mẫu trên khay đƣợc ổn nhiệt tại 100
C và thời gian bảo quản mẫu < 24h.
Chọn cột tách
Cột tách góp một phần khá quan trọng trong việc quyết định quá trình tách có độ phân giải tốt hay không. Để chọn loại cột có pha tĩnh phù hợp cần căn cứ vào cấu trúc phân tử và độ phân cực của chất phân tích. Với đối tƣợng cần tách là 7 HCBVTV đều có tính chất tan tốt trong nƣớc, pha động phân cực nên cột tách sử dụng phải là cột pha đảo. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng cột Agilent ZorbaxSB C18 với các thông số cột nhƣ sau:
ZorbaxSB C18 (150mm × 4.6mm × 5µm) hoặc tƣơng đƣơng Nhiệt độ cột: 400C
Khảo sát thành phần pha động và chế độ chạy
Pha động và pha tĩnh là hai yếu tố trực tiếp ảnh hƣởng tới điều kiện tách sắc ký. Việc lựa chọn pha động rất quan trọng vì pha động có thể ảnh hƣởng tới độ chọn lọc của hệ pha, thời gian lƣu trữ, hiệu quả tách của cột, độ rộng của pic sắc ký ...Vì các HCBVTV trong nghiên cứu tan tốt trong nƣớc và căn cứ giá thành đề tài đã chọn hệ dung môi là nƣớc và acetonitril [25].
Khảo sát tốc độ dòng pha động
Tốc độ dòng pha động liên quan đến quá trình thiết lập cân bằng của chất tan trong hai pha tĩnh và pha động. Khi tốc độ pha động nhỏ, chất phân tích ra muộn, gây doãng chân pic, giảm độ nhạy và tốn dung môi. Ngƣợc lại, khi tốc độ pha động quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp mẫu chƣa kịp tách ra khỏi nhau, dẫn đến hiện tƣợng chồng pic và gây áp suất lớn trong bơm [15].
Trong chế độ chạy trộn dung môi, khi cố định chế độ đo phần MS/MS bằng cách tăng dần tỷ lệ ACN và thay đổi tốc độ pha động ở các mức:0,5; 0,6; 0,7 ; 0,8 ; 0,9 và 1 ml/phút căn cứ độ hẹp pic, độ cân xứng của pic để lựa chọn. Thực nghiệm cho thấy tại tỷ lệ thể tích của hai kênh A và kênh B là 65% : 35%, tốc độ dòng là 0,6 ml/phút píc thu đƣợc nhọn, hẹp và cân đối.
53
Hình 3.3: Sắc ký TIC 7 HCBVTV
Chúng tôi nhận thấy tốc độ dòng thực nghiệm (0,6 ml/phút) nhỏ hơn so mức khuyến cáo của nhà sản suất (1 ml/phút). Nhƣng điều này là phù hợp với hệ thống HPLC-MS/MS vì tốc độ dòng thấp sẽ thuận lợi cho quá trình hóa hơi dung môi, tách và ion hóa hoạt chất phân tích của nguồn ion hóa ESI.
Bảng 3.2. Tóm tắt điều kiện tốc độ dòng pha động để tách hỗn hợp HCBVTV
Thời gian (phút) Tốc độ dòng (mL/phút) Kênh A Kênh B 0,01 0,6 65 35 1,00 0,6 65 35 7,00 0,6 100 0 10,00 0,6 100 0 10,10 0,6 65 35 12,00 0,6 65 35
3.2.1.2. Khảo sát các điều kiện khối phổ MS/MS
Để phân tích HCBVTV bằng sắc ký lỏng khối phổ MS/MS cần phải xác định đƣợc ion phân tử (ion mẹ) và ion sản phẩm (ion con) của HCBVTV. Với nguồn ion hóa ESI, chế độ ion dƣơng các ion phân tử thƣờng đƣợc tạo thành bằng cách thêm một proton vào khối lƣợng phân tử của chất đó. Dựa vào khối lƣợng phân tử của các HCBVTV, trên cơ sở tham khảo các nghiên cứu trƣớc đây trên thế giới, chúng tôi đã xác định đƣợc các ion phân tử của từng HCBVTV (bảng 2.4).
Tuy nhiên, để định tính và định lƣợng cần phải xác định đƣợc ion sản phẩm của từng HCBVTV. Sử dụng kim tiêm mẫu 20 µl tiêm trực tiếp các chất chuẩn HCBVTV có nồng độ 160 ng/ml vào MS để xác định hai ion con ứng với từng chất. Ion con có
54
tín hiệu lớn hơn đƣợc sử dụng để làm ion định lƣợng, ion con có tín hiệu thấp hơn đƣợc dùng cho mục đích xác nhận (khẳng định). Các thông số bắn phá nhƣ Dwell time (Chu kỳ quét), Fragmentor (Điện áp phân mảnh), và CE (năng lƣợng va chạm) đƣợc tối ƣu tự động theo thiết bị MS. Các kết quả đƣợc tổng hợp ở bảng 2.4.
Bảng 3. 3: Điều kiện tối ƣu cho thiết bị HPLC – MS/MS
HPLC MS/MS
Tỷ lệ kênh A : B = 60% : 35% Chế độ ion hóa : ESI-posetive Tốc độ dòng : 0,6 ml/phút Chu kỳ quét : theo bảng 2.3
Áp suất đầu phun :4000V Điện thế phân mảnh : theo bảng 2.3 Năng lƣợng va chạm : theo bảng 2.3
3.2.2. Nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp 3.2.2.1.Tính chọn lọc, đặc hiệu của phƣơng pháp 3.2.2.1.Tính chọn lọc, đặc hiệu của phƣơng pháp
Tính chọn lọc, đặc hiệu của phƣơng pháp phân tích đa dƣ lƣợng thể hiện khả năng phân biệt một chất với các chất còn lại và với nền mẫu. Để đánh giá tính chọn lọc, đặc hiệu chúng tôi phân tích các mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn. Hình 3.4 và 3.5 giới thiệu sắc đồ của hỗn hợp chuẩn trên mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn.
Mẫu trắng là mẫu không chứa các HCBVTV trong nghiên cứu, đƣợc thực hiện theo quy trình chiết mẫu (Hình 2.1).
Mẫu thêm chuẩn là mẫu trắng đƣợc bổ sung thêm một lƣợng chất chuẩn cần phân tích đã biết trƣớc nồng độ. Mẫu thêm chuẩn đƣợc chuẩn bị và phân tích nhƣ đối với các mẫu thực để xem xét quá trình thực hiện của một phƣơng pháp phân tích.
55
Hình 3.4. Sắc đồ TIC ở mẫu trắng
Hình 3.5. Sắc đồ pic TIC ở mẫu thêm chuẩn
Nhận xét: Thời gian lƣu của các HCBVTV trên nền mẫu thêm chuẩn hoàn toàn giống với trên mẫu chuẩn (hình 3.1), không xuất hiện pic ở mẫu trắng ở cả hai ion con..
Mặt khác, với mỗi chất ta có hai ion con dùng để định lƣợng và khẳng định do đó sự có mặt của HCBVTV đƣợc chắc chắn. Điều này đáp ứng đƣợc yêu cầu của các tổ chức trên thế giới nhƣ AOAC, Châu Âu [21,22, 37, 38].
3.2.2.2. Khảo sát xây dựng đƣờng chuẩn
Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc của diện tích pic sắc ký vào nồng độ của các chất chuẩn để tìm giới hạn tuyến tính và lập đƣờng chuẩn. Từ dung dịch chuẩn gốc (stock) pha các dãy dung dịch chuẩn sau :
- Dãy dung dịch chuẩn trung gian : 100; 10; 1; 0,1 µg/ml
- Dãy dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ là : 10; 20; 40; 80; 160 ng/ml
Trong đó các dung dịch chuẩn trung gian pha trong ACN. Dung dịch chuẩn làm việc định mức bằng hỗn hợp ACN.
56
Tiến hành bơm vào hệ thống HPLC-MS/MS theo các điều kiện đã tối ƣu ở trên. Tại mỗi nồng độ lặp lại 2 lần (riêng tại nồng độ 10 ng/ml thì lặp lại nhiều hơn)
Kết quả khảo sát các thông số biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ của Fluoxastrobin và diện tích pic tƣơng ứng đƣợc thể hiện trong bảng 3.4:
Bảng 3.4: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ chuẩn Fluoxastrobin
Tên Kiểu mẫu
Các mức nồng độ (ng/ml) Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (pA*Hz) Nồng độ tính theo đường chuẩn (ng/ml) Độ chính xác (%) ACN DM ACN DM ACN DM Fluoxastrobin 10 ng/ml Chuẩn L5 7,283 3310,37 8,772 97,104 Fluoxastrobin 10 ng/ml Chuẩn L5 7,276 3336,47 9,116 97,122 Fluoxastrobin 10 ng/ml Chuẩn L5 7,219 3368,88 10,001 99,884 Fluoxastrobin 10 ng/ml Chuẩn L5 7,267 3436,54 10,118 100,147 Fluoxastrobin 10 ng/ml Chuẩn L5 7,209 3411,81 10,115 102,154 Fluoxastrobin 10 ng/ml Chuẩn L5 7,258 3322,16 9,993 100,115 Fluoxastrobin 20 ng/ml Chuẩn L4 7,274 6546,96 21,848 107,989 Fluoxastrobin 20 ng/ml Chuẩn L4 7,236 6584,15 21,224 105,155 Fluoxastrobin 40 ng/ml Chuẩn L3 7,247 13245,51 41,887 107,695 Fluoxastrobin 40 ng/ml Chuẩn L3 7,258 13336,48 41,554 105,360 Fluoxastrobin 80 ng/ml Chuẩn L2 7,231 25655,15 81,878 97,873 Fluoxastrobin 80 ng/ml Chuẩn L2 7,218 25991,51 82,635 101,740 Fluoxastrobin 160 ng/ml Chuẩn L1 7,278 50874,79 159,935 97,475 Fluoxastrobin 160 ng/ml Chuẩn L1 7,291 51224,32 159,114 95,590
57
Từ kết quả thu đƣợc ở bảng3.7, chúng tôi xác định các giá trị: giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn đinh lƣợng (LOQ), giới hạn tuyến tính của đƣờng chuẩn (LOL) để từ đó xác định khoảng tuyến tính của đƣờng chuẩn .
Trong thiết bị phân tích, phần mềm Agilent-Mass Hunter B1.0 giúp lập đƣờng chuẩn bậc nhất dạng hồi quy khối để từ đó xác định đƣợc giá trị LOD, LOQ và LOL.
Hình 3.6: Đƣờng chuẩn của Fluoxastrobin trong khoảng tuyến tính Bảng 3.5: Các thông số đƣờng chuẩn đối với các HCBVTV (Curve fit)
Name Weight R2 Standard Error Equation Sulfoxaflor 1/x 0,999394 0,6 y= 17,4738x+342654 Isotianil 1/x 0,974679 28,1 y = 22,6282x+1733,1911 Indaziflam 1/x 0,994084 7,1 y = 62,4035x+23,1915 Fluoxastrobin 1/x 0,998200 31,8 y = 318,0592x+214,0728 Cyantraniliprole 1/x 0,997716 3,3 y = 38,8505x+209,0456 Chlorantraniliprole 1/x 0,997349 3,7 y = 55,1311x+28,1720 Trifloxystrobin 1/x 0,999520 87,1 y = 871,9593+389,5497
58
Kết quả phân tích cho thấy phƣơng trình hồi quy (Fluoxastrobin) là bậc nhất có dạng : y = 318,0592x+214,0728trong đó y là diện tích pic, x là nồng độ chất chuẩn bơm vào (ng/ml); hệ số tƣơng quan r2 = 0,998200; độ lệch chuẩn của phƣơng trình hồi quy là Sy = 31,8 (bảng 3.6)
Thực nghiệm cũng cho thấy khi bơm lặp lại 5 lần tại nồng độ thấp nhất 10 ng/ml, theo các điều kiện tối ƣu tìm đƣợc thì thiết bị có độ ổn định cao (RSD% < 7%)(bảng 3.6)
Bảng 3.6: Độ lặp lại của thiết bị tại nồng độ Fluoxastrobin tại 10 ng/ml
Dung dịch đo Thời gian lƣu Diện tích píc Nồng độ tìm đƣợc S/N ACN Fluoxastrobin 10 ng/ml 7,283 3310,37 8,772 18,147324 Fluoxastrobin 10 ng/ml 7,276 3336,47 9,116 15,775919 Fluoxastrobin 10 ng/ml 7,219 3368,88 10,001 17,525804 Fluoxastrobin 10 ng/ml 7,267 3436,54 10,118 14,366194 Fluoxastrobin 10 ng/ml 7,209 3411,81 10,115 15,164036 Độ lệch chuẩn 0,03 52,003 0,63 2,52 Giá trị trung bình 7,25 3372,814 9,62 16,37 %RSD 0,47 1,54 6,59 15,39
3.3.2.3. Giới hạn phát hiện LOD
Giới hạn phát hiện (LOD) đƣợc định nghĩa là nồng độ thấp nhất (xL) của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích (yL) khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền. Tức là: yL= yB k.SB với yB là tín hiệu trung bình của mẫu trắng sau nb thí nghiệm; Sb là độ lệch chuẩn tín hiệu của mẫu trắng; k là đại lƣợng số học đƣợc chọn theo độ tin cậy mong muốn[12].
nb j bj b b y n y 1 1 nb i b bi b b x x n S 1 2 2 ) ( 1 1 , nhƣ vậy, b S k x xL B B .
59
Chúng tôi xác định giới hạn phát hiện LOD bằng tính toán, sau đó kiểm chứng bằng thực nghiệm.
*Phương pháp tính toán
Theo lí thuyết thống kê trong hoá phân tích [10]
b S
LOD 3. y (*)
Trong đó:
- b là hệ số trong phƣơng trình hồi quy y = 871,9593x+389,5497
- Sy là độ lệch chuẩn của mẫu trắng, đƣợc coi bằng sai số của phƣơng trình hồi quy Sb
= Sy = 31,8 . Nhƣ vậy xLOD = 0,29 ng/ml. Vì LOD phụ thuộc vào thành phần nền của mẫu phân tích nên dung dịch chuẩn đƣợc pha trên nền dịch chiết của mẫu trắng.Để thuận tiện cho tính toán chúng tôi lấy xLOD = 0,30 ng/ml
*Phương pháp trực tiếp
Theo ISO/IEC 17025 : 2005 hƣớng dẫn thì LOD là nồng độ nhỏ nhất mà cho tỷ số S/N ≥ 3 (sign/noise) [10,29]. Do đó chúng tôi kiểm chứng lại tại nồng độ xLOD = 0,30 ng/ml.
3.3.2.4. Giới hạn định lƣợng LOQ
Giới hạn định lƣợng đƣợc định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà phép phân tích vẫn định lƣợng đƣợc chính xác với độ tin cậy 95%. Theo lý thuyết thống kê trong hoá phân tích thì LOQ là nồng độ chất phân tích mà cho tín hiệu gấp 10 lần tín hiệu đƣờng nền (S/N = 10).
b S XLOQ 10. y
Vì vậy, giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp (bằng tính toán và cần kiểm tra qua hiệu suất thu hồi) XLOQ = 0,99 ≈ 1 ng/ml
Để thuận tiện trong pha mẫu spike và để đạt %RSD chúng tôi lấy XLOQ = 1 ng/ml. Điều này sẽ đƣợc kiểm chứng trong mục 3.3.2.5. về đánh giá độ chính xác của phƣơng pháp
60
Do thiết bị HPLC – MS/MS có độ nhậy và độ chọn lọc rất tốt có thể phân biệt tới fentogram/ml nên khi tăng nồng độ chất phân tích có thể làm nhiễm bẩn hệ thống. Vì vậy chúng tôi chọn nồng độ phân tích từ 10 ng/ml đến 160 ng/ml (nhằm giảm số lần chạy chất chuẩn trong một dãy mẫu phân tích) và sẽ đánh giá hiệu suất thu hồi , %RSD trên khoảng này.
3.3.2.5. Khảo sát điều kiện chiết hỗn hợp chuẩn trong mẫu thực
Trong phân tích lƣợng vết, cơ chất thực vật có ảnh hƣởng trực tiếp đến kết quả phân tích. Làm sạch là giai đoạn quan trọng phải đảm bảo mẫu chạy ổn định, nhiễu nền ít ảnh hƣởng đến kết quả và tránh làm bẩn làm hỏng với detecter cho hệ MS/MS vốn rất nhạy. Các chất làm sạch đƣợc lựa chọn phải đáp ứng hấp phụ cơ chất thực vật nhƣng không hấp phụ hoạt chất cần phân tích. Các chất làm sạch đƣợc lựa chọn là :
- Than hoạt tính GCB : dùng khử các chất diệp lục, chất tạo mầu
- Bột C18EC : dùng khử các chất béo, lipid, protein...
- QuEchERS EN 15662 sử dụng chất làm sạch PSA (Primary-secondary amine - chất hấp phụ amin bậc 1,2)
Thực nghiệm cho thấy GCB hiệu quả làm sạch cơ chất cao nhƣng hầu nhƣ hấp thụ hầu hết HCBVTV trong nghiên cứu. Với mẫu rau nhƣ cải bắp, dƣa chuột, thanh long màu cơ chất giảm đi rõ rệt. Vì vậy chúng tôi không chọn GCB trong nghiên cứu này, thay vào đó, chúng tôi chọn PSA, vì PSA không hấp thụ các HCBVTV trong nghiên cứu này. Bằng cảm quan và xem xét tín hiệu đƣờng nền của phổ chúng tôi chọn lƣợng MgSO4 và PSA lần lƣợt 4g; 0,3g để làm sạch mẫu sau đó nghiên cứu các điều kiện chiết HCBVTV ra khỏi mẫu .
Khảo sát ảnh hƣởng thể tích 5% acid formic đến hiệu suất thu hồi
Cân 10 g/mẫu đối chứng dƣa chuột (cân 7 lƣợng cân), thêm 0,1 ml dung dịch chuẩn Mix 7 1000 ng/ml vào mỗi mẫu, sau đó thêm 10 ml ACN. Thêm các thể tích acid formic khác nhau nhƣ ở bảng 3.7 vào 2 ml dịch chiết cuối cùng trƣớc khi bơm vào máy. Xử lý mẫu với quy trình chiết ở trên rồi bơm vào hệ thống HPLC – MS/MS chạy các điều kiện tối ƣu đã khảo sát ở trên. Nồng độ mẫu thêm chuẩn thu đƣợc tính theo đƣờng chuẩn.
61
Bảng 3.7: Ảnh hƣởng Vacid formic đến hiệu suất thu hồi trên mẫu thêm chuẩn
m (g) Vacid formic (μl) Số ml chuẩn 1000 (ng/ml) thêm vào ồng độ chuẩn thêm vào (ng/ml) Hiệu suất thu hồi (%) 10 0 0,1 10 66,4 10 2 0,1 10 73,2 10 5 0,1 10 86,4 10 10 0,1 10 83,6 10 25 0,1 10 33,6 10 20 0,1 10 13,0 10 25 0,1 10 10,2
Từ các số liệu bảng 3.8, ta thấy khi thêm 10 µl axit formic vào 10 ml dịch mẫu thì hiệu suất chiết đạt giá trị cực đại và pic sắc ký của mẫu spike và chuẩn tƣơng tự nhau (hình 3.7, 3.8).
62
Hình 3.7: Sắc ký đồ EIC và phổ khối của mẫu thêm chuẩn tại 10 ng/ml
Hình 3.8: Sắc ký đồ EIC và phổ khối của chuẩn Fluoxastrobin tại 10 ng/ml
3.3.2.6. Đánh giá độ chính xác của phƣơng pháp
Độ chính xác của phƣơng pháp phân tích có ý nghĩa quyết định giá xem phƣơng pháp phân tích có khả năng ứng dụng hay không. Theo ISO 5725: 1994 độ chính xác của phƣơng pháp (accuracy) đƣợc đánh giá qua độ đúng (truness) và độ chụm (precision) [13].
Trong đó độ đúng đƣợc đánh giá qua độ chệch – Bias (tƣơng đƣơng với hiệu suất thu hồi – Recovery) bao gồm độ chệch trong nội bộ phòng thí nghiệm (Laboratory bias) và thử nghiệm liên phòng .Với độ chụm chúng tôi đánh giá qua độ lệch chuẩn lặp