Đầu tiên Michelangelo Anastassiades [32] đề xuất quy trình QuEChERS nhƣ sau:
- Giai đoạn xử lý mẫu : Mẫu nông sản ban đầu (cách lấy mẫu tùy thuộc vào đối tƣợng và theo hƣớng dẫn phòng thí nghiệm hoặc theo quy định quản lý cấp cao hơn ) đƣợc xử lý sơ bộ nhƣ : loại bỏ phần đất, sỏi ... không liên quan. Sau đó mẫu đƣợc nghiền nhỏ, mịn (lý tƣởng là đƣợc nghiền trạng thái đông lạnh) để giảm tối đa sự khác biệt trong một mẫu và tăng tối đa bề mặt tiếp xúc cho quá trình chiết. Với những mẫu thô nhƣ hoa quả thì đƣợc cắt ở kích cỡ < 3x3 cm sau đó mới đem đồng nhất mẫu. Sau khi đồng nhất mẫu đƣợc cân một lƣợng phù hợp để phân tích ngay hoặc bảo quản nhiệt độ < -20o
C.
- Cân 10 – 15 gam/mẫu vào ống tuyp ly tâm loại 50ml có nắp kín. Với mẫu có hàm lƣợng nƣớc thấp nhƣ chè, gạo, ngũ cốc thì cần thêm nƣớc vào để hàm lƣợng nƣớc > 75% để trong 2 h.
- Thêm 10 ml axetonitril (ACN) rung lắc mạnh khoảng 2 – 3 phút. Sau đó thêm MgSO4, NaCI, hỗn hợp muối đệm xitrat Na3C6H5O7và Na2C6H6O7 sao cho pH mẫu đạt 5 -5,5 [32].
- Rung lắc mạnh 2-3 phút và ly tâm 3000vòng/phút trong 5 phút để pha hữu cơ đƣợc phân tách. Thu pha hữu cơ và thêm các chất hấp phụ amin nhƣ PSA, than hoạt tính (GCB) để làm sạch loại bỏ cơ chất thực vật, chất diệp lục. Tiến hành ly tâm lần nữa, thu lấy pha hữu cơ đem thổi khô bằng khí N2 . Tùy thuộc thiết bị phân tích là hệ GC-MS/FPD/µECD hay HPLC-MS/MS mà định mức bằng dung môi thích hợp [37].
Hiện nay để thuận tiện trong chiết tách ngƣời ta đóng gói sẵn hỗn hợp muối vô cơ, muối đệm, chất làm sạch (PSA, GCB) thành những bộ kit (dạng dung dịch hoặc dạng bột rất mịn). Hiển nhiên tùy theo đối tƣợng nông sản và hoạt chất pesticide quan tâm mà thành phần mỗi bộ kit là khác nhau. Chính vì có nhiều hoạt chất và nhiều loại nông sản khác nhau mà hiện nay tồn tại nhiều quy trình khác nhau.
38
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu là 7 hóa chất bảo vệ thực vật gồm: Sulfoxaflor, Indaziflam, Isotianil, Cyantraniliprole, Chlorantraniliprole, Trifloxystrobin, Fluoxastrobin.
Các loại nông sản nhƣ: Dƣa hấu, Cà chua, Bắp cải, Thanh long, Chè, Nhãn, Dƣa chuột.
2.1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Mục tiêu chung của đề tài là nghiên cứu phƣơng pháp xác định đồng thời 7 HCBVTV nông sản bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ - khối phổ LC/MS/MS với 3 mục tiêu cụ thể nhƣ sau:
- Khảo nghiệm hiệu lực của các loại thuốc BVTV sau (bảng 2.1)
Tên thuốc Hoạt chất Dịch hại Cây trồng Địa điểm Closer 500WG Sulfoxaflor Bọ phấn (Bemisia tabaci) Cà chua Ninh Bình Thái Bình Rountine 200SC Isotianil Thối nhũn (Erwinia caratovora) Bắp cải Bắc Giang Vĩnh Phúc Becano 500SC Indaziflam Cỏ(Commelina
communis)
Chè Vĩnh Phúc Hòa Bình Evito-C 660SC Fluoxastrobin Đốm nâu
(Neoscytalidiu m dimidiatum) Thanh long Thái Nguyên Vĩnh Phúc Dupont Benevia 100OD Cyantranilipole Bọ trĩ (Thrips palmi) Dƣa chuột Thái Bình Ninh Bình Nativo 750WG Trifloxystrobin Đốm đen quả
(Collectotrichu m sp)
Nhãn Hòa Bình Thái Nguyên Voliam Targo Chlorantraniliprole Rệp (Aphids Dƣa hấu Bắc Giang
39
63SC gossyii Glover) Ninh Bình Bảng 2.1. Khảo nghiệm hiệu lực các loại thuốc BVTV
- Xây dựng phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng một số hóa chất bảo vệ thực vật nông sản, bao gồm:
Khảo sát các điều kiện phân tích
Thẩm định phƣơng pháp đã xây dựng
- Áp dụng phƣơng pháp để phân tích hóa chất bảo vệ thực vật trong nông sản miền Bắc Việt Nam, từ đó xác đinh thời gian cách ly – PHI
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.1. Chuẩn bị dung môi pha động và dung dịch chuẩn
- Chuẩn bị dung môi pha động
Dung dịch kênh A: ACN/H2O 2+8 (v/v) + 5mM CH3COONH4: Cân 0,385g CH3COONH4 vào bình định mức 1L, thêm 200ml ACN, định mức tới vạch bằng nƣớc cất 2 lần khử ion, lắc kỹ, siêu âm 15 min.Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 m trƣớc khi đƣa vào hệ thống HPLC-MS/MS.
Dung dịch kênh B: ACN/H2O 9+1 (v/v) + 5mM CH3COONH4: Cân 0,385g CH3COONH4 vào bình định mức 1L, thêm 900ml ACN, định mức tới vạch bằng nƣớc cất 2 lần khử ion, lắc kỹ, siêu âm 15 min.. Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 m trƣớc khi đƣa vào hệ thống HPLC-MS/MS.
- Chuẩn bị dung dich chuẩn
+ Dung dịch chuẩn gốc – 1000 µg/ml
Cân khoảng 0,01g các chất chuẩn chính xác tới 0,00001g vào bình định mức 10 ml, hoà tan và định mức tới vạch bằng axetonitril đƣợc dung dịch chuẩn gốc.
Chú ý: Do chất chuẩn bảo quản ở - 20oC nên phải đƣa về nhiệt độ phòng trƣớc khi cân. Dung dịch chuẩn sau khi pha bảo quản ở 0 -5 o
C
+ Dung dịch chuẩn làm việc
Bằng cách pha loãng liên tục và định mức bằng hồn hợp dung môi pha động và ACN đƣợc các mức nồng độ chuẩn làm việc 10, 20, 40, 80, 160 ng/ml.
40
2.2.2. Các hoá chất khác
Các loại hóa chất dùng trong phƣơng pháp phân tích đều thuộc loại hóa chất tinh khiết phân tích (P.A.) gồm :
- Chất chuẩn Sulfoxaflor, Isotianil, Indaziflam, Cyantraniliprole, Chlorantraniliprole, Trifloxystrobin, Fluoxastrobin.
- Formic acid
- Methanol (MeOH) - Acetonitril ACN - Sodium chloride NaCl
- Magnesium sulfate heptahydrate MgSO4..7H2O (nung 550oC trong 8 giờ, để nguội, cho vào bình đậy kín, bảo quản trong binh hút ẩm)
- Sodium hydrogencitrate sesquihydrate (C6H5Na2O7.1.5H2O) - Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7.2H2O)
- Amoni acetat (CH3COONH4)
- Primary secondary amine (PSA) kích thƣớc hạt 40-60 µm - Nƣớc trao đổi ion
2.2.3. Dụng cụ
- Bình định mức dung tích 10ml±0,04 ; 20ml±0,04 ; 50ml±0,06 - Ống đong dung tích 1000ml
- Ống ly tâm, có nắp xoáy dung tích 15ml, 50 ml - Pipet loại 1ml±0,01; 2ml±0,01; 10ml±0,05 - Micropipet 50-200 μl
- Ống đựng mẫu chiết 2,0 ml
2.2.4. Thiết bị
- Máy sắc kí lỏng khối phổ LC-MS/MS 6410MS (Agilent) - Cột Zorbax SB18 150mm x 4,6mm, 5µm
- Máy sắc ký lỏng HPLC 1100 (Agilent) - Cột Zorbax SB C18 250mm x 4,6mm, 5µm
- Cân phân tích có độ chính xác đến 0,00001 g - Cân kỹ thuật có độ chính xác đến 0,1 g
41
- Máy ly tâm Rotina 38R buồng lạnh 5 – 40oC, tốc độ ly tâm 1000 – 15000 vòng/phút
- Máy Vortex Genie 2TM điều chỉnh tốc độ lắc - Máy đo pH: pH Meter 744
- Máy siêu âm Sonorex Super RK514BH kết hợp gia nhiệt bể siêu âm, thời gian siêu âm tùy biến (1-15 phút)
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Khảo sát điều kiện khảo nghiệm
Tiến hành khảo sát địa điểm khảo nghiệm ở các tỉnh thuộc miền Bắc Việt Nam, các vùng chuyên canh trồng rau,cây ăn quả, đại diện cho các vùng sản xuất nhƣ Hòa Bình, Thái Nguyên, Ninh Bình, Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Thái Bình.
Nội dung tiến hành gồm :
- Khảo nghiệm đƣợc bố trí trên những ruộng cây trồng thƣờng có dịch hại nêu ở bảng 2.1.
- Điều kiện trồng trọt (đất, phân bón, giống cây trồng, mật độ trồng) phải đồng đêu trên toàn khu khảo nghiệm và phù hợp với tập quán canh tác tại địa phƣơng.
- Trong thời gian khảo nghiệm không đƣợc dùng bất kỳ một loại thuốc trừ sâu khác trên khu khảo nghiệm. Nếu khu khảo nghiệm bắt buộc phải dùng thuốc để trừ các dịch hại khác nhƣ: bệnh, cỏ dại, điều hòa sinh trƣởng… thì thuốc đƣợc dùng để trừ các dịch hại này phải không làm ảnh hƣởng đến thuốc cần khảo nghiệm, không làm ảnh hƣởng đến đối tƣợng khảo nghiệm và phải đƣợc phun rải đều trên tất cả các ô khảo nghiệm
- Khi xử lý thuốc không để thuốc ở ô khảo nghiệm này tạt sang ô khảo nghiệm khác.
2.3.2. Khảo nghiệm hiệu lực sinh học và xác định thời gian cách ly 2.3.2.1. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm 2.3.2.1. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm
Tiến hành thí nghiệm ở diện rộng (1500m2), các ô đƣợc bố trí theo kiểu tuần tự.
- Diện tích mỗi ô đơn vị: 300m2 - Nhắc lại: 0 lần
- Các ô khảo nghiệm phải có hình vuông hay hình chữ nhật nhƣng chiều dài phải không vƣợt quá hai lần chiều rộng.
42
- Giữa các công thức khảo nghiệm phải có dải phân cách rộng ít nhất là 1 luống, 1 hàng cây đối với cây ăn quả (thanh long, nhãn)
Bảng 2.2: Công thức thí nghiệm khảo nghiệm thuốc BVTV
STT Tên thuốc khảo nghiệm Dịch hại/Cây trồng
Liều lƣợng Thời điểm xử lý
1 Closer 500WG
Bọ phấn/Cà chua
150 g/ha Thuốc đƣợc phun 1 lần khi dƣa chuột bị bọ phấn xuất hiện gây hại, mật độ
3-5 con/lá 2 Rountine 200SC Thối nhũn/Bắp cải 0,4l/ha Thuốc đƣợc xử lý phòng trƣớc khi bênh xuất hiện(khoảng 40
ngày sau khi ra ngôi) 3 Becano
500SC
Cỏ/chè 0,15l/ha Thuốc đƣợc xử lý một lần khi làm đất sạch, khi đất đã sạch cỏ. 4 Evito-C 660SC Đốm nâu/Thanh long
0,5% Lần đầu khi bệnh chớm xuất hiện, tỷ lệ khoảng 5-10% 5 Dupont benevia 100OD Bọ trĩ/Dƣa chuột
1,25l/ha Thuốc đƣợc phunkhi bọ trĩ mới xuất hiện, mật độ khoảng
2-3 con /lá 6 Nativo
750WG
Đốm đen quả/Nhãn
0,25% Thuốc đƣợc phun 1 lần khi tỷ bệnh từ 4,93 -5,85 % 7 Voliam Targo 63SC Rệp/Dƣa hấu
0,3l/ha Thuốc đƣợc phun lần 1 khi mật độ rệp khoảng 8 con/lá. Phun
lần 2 cách lần đầu 7 ngày 8 Đối chứng Phun nƣớc lã -Lƣợng nƣớc thuốc: 400-500 lít/ha
- Dụng cụ phun: Bình bơm tay đeo vai
2.3.2.2. Chỉ tiêu và phƣơng pháp điều tra Chỉ tiêu điều tra : Chỉ tiêu điều tra :
- Xác định tỉ lệ bệnh, mật độ côn trùng trƣớc khi xử lý thuốc và 1,3,7 ngày sau xử lý
- Hiệu lực của thuốc ở các ngày sau xử lý
43
- Ảnh hƣởng của thuốc với cây ở 1,3,7 ngày sau xử lý theo Quy phạm khảo nghiệm trên đồng ruộng số 10 TCN415 – 2000 của Bộ Nông nghiệp và PTNT nhƣ sau:
Cấp triệu trứng nhiễm độc của cây trồng: 1 – Cây bình thƣờng
2 – Sinh trƣởng cây giảm nhẹ
3 – Ngộ độc tăng lên, sinh trƣởng của cây giảm nhƣng triệu chứng (màu sắc, hình dạng ...) chƣa rõ ràng.
4 – Có triệu chứng ngộ độc nhƣng chƣa ảnh hƣởng đến năng suất 5 – Cây biến màu thuốc gây ảnh hƣởng đến năng suất
6 – Thuốc làm giảm năng suất ít
7 – Thuốc gây ảnh hƣởng nhiều tới năng suất 8–Triệu chứng ngộ độc tăng dần tới làm chết cây 9 – Cây bị chết hoàn toàn
Phƣơng pháp điều tra:
- Đối với cà chua: Mỗi ô chọn 10 điểm trên 2 đƣờng chéo góc, mỗi điểm điều tra 20 lá, đếm số bọ phấn sống. Cố định các điểm trong thời gian khảo nghiệm
- Đối với bắp cải: Mỗi ô điều tra tại 10 điểm trên 2 đƣờng chéo góc, mỗi điểm điều tra 10 cây cố định. Các điểm điều tra cách mép ô khảo nghệm 0.5m.
- Đối với dƣa chuột: Mỗi ô chọn 10 điểm trên 2 đƣờng chéo góc, mỗi điểm chọn 2 ngọn (ngọn bao gồm 1 đọt non và 2 lá kế tiếp), Đếm số lƣợng bọ trĩ sống bằng kính lúp cầm tay.
- Đối với chè: Mỗi ô chọn 10 điểm trên 2 đƣờng chéo góc. Đếm toàn bộ số cỏ dại rồi phân thành các nhóm cỏ chính.
- Đối với thanh long: Mỗi ô khảo nghiệm theo dõi 3 nọc. Trên mỗi nọc theo dõi 4 cành cố định, đại diện cho 4 hƣớng. Mỗi cành theo dõi một đoạn cành dài 30cm. Quan sát và phân cấp mực độ bệnh ở cả 3 mặt của đoạn cành.
- Đối với nhãn: Mỗi ô chọn 6 cây ngẫu nhiên, môi cây điều tra tất cả các chùm quả trên 4 cành cố định ở 4 hƣớng của cây
44
2.3.3. Phƣơng pháp xử lý mẫu thu hoạch sau khảo nghiệm
Mẫu đƣợc lấy theo tiêu chuẩn lấy mẫu ngoài đồng ruộng TCVN 5139:2009, và đƣợc xử lý theo quy trìnhQuEChERS đã nghiên cứu:
- Cân 10 gam/mẫu đã đƣợc cắt nhỏ và đồng nhất vào ống tuyp ly tâm loại 50ml có nắp kín.
- Thêm 10 ml acetonitril (ACN) rung lắc mạnh khoảng 2 – 3 phút. Sau đó thêm 4 MgSO4, 1 g NaCI, hỗn hợp muối đệm citrat 1 g Na3C6H5O7 và 0,5 g Na2C6H6O7 , đo pH mẫu đạt 5 -5,5.
- Rung lắc mạnh 2-3 phút và ly tâm 3000vòng/phút trong 5 phút để pha hữu cơ đƣợc phân tách. Hút 4 ml pha hữu cơ và thêm các chất hấp phụ PSA, 1g MgSO4, lắc khoảng 30 giây. Tiến hành ly tâm lần nữa, thu lấy pha hữu cơ, thêm 5% axit fomic vào 2ml dịch chiết rồi phân tích bằng LC-MS/MS
45
Hình 2. 1: Quy trình phân tích mẫu
2.3.4. Điều kiện phân tích
2.3.4.1. Điều kiện phân tách trên hệ thống HPLC
Cột phân tích : ZORBAX SB RPC18 150mm x 4,6 mm, 5 m - Nhiệt độ cột : 400C
- Tốc dòng : 0,6 ml/phút - Thể tích bơm mẫu : 20 l
Chƣơng trình dung môinhƣ sau: tỷ lệ kênh %A: %B = 65: 35, trong thời gian 12 phút/ mẫu.
Mẫu (>1kg) đƣợc cắt nhỏ ra, lấy khoảng 200g mẫu đại diện và đồng nhất bằng thiết bị đồng nhất mẫu
Chuyển 10g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm 50ml Thêm 10ml ACN +1g Na3C6H5O7 .1,5 H2O + 1 g NaCl + 0,5 g
Na2C6H6O7. 2H2O +4 g MgSO4
Lắc mạnh trong khoảng 2-3 phút, sau đó ly tâm với tốc độ 3000 vòng /phút và trong 5 phút
Chuyển 4ml vào ống ly tâm 15ml trong đó đã có 100mg MgSO4+30 mg PSA/ml dịch chiết và lắc trong khoảng 30 giây
Ly tâm 3000 vòng/phút trong khoảng 5 phút
Chuyển 2 ml dịch chiết vào vial 2 ml và thêm 5% acid formic và lắc đều
46
2.3.4.2. Điều kiện phân tích trên hệ thống khối phổ ESI - MS/MS :
Nguồn ion hóa (ESI) áp dụng các thông số nhƣ bảng 2.3
Bảng 2.3: Các thông số của chế độ ion hóa ESI Nguồn ion hóa: ESI/ posetive/MRM Nhiệt độ khí N2: 300 oC
Lƣu lƣợng khí N2: 7 L/phút Áp suất đầu phun: 20 psi Điện áp mao quản: 4000 V
Chế độ quét MS/MS:MRM (SIM to SIM) với các thông số nhƣ bảng 2.4 Bảng 2.4: Các thông số chế độ quét MS/MS
Hoạt chất Thời gian lƣu (phút) Ion sơ cấp Ion thứ cấp Chu kỳ quét (ms) Điện áp phân mảnh (V) Năng lƣợng va chạm (V) Sulfoxaflor 3,47 278,0 174,0 80 70 10 154,0 80 70 10 Chlorantraniliprole 5,3 484,0 453,0 100 70 15 286,0 100 70 8 112,0 100 70 20 Cyantraniliprole 4,4 475,0 286,0 80 70 10 284,0 80 70 10 Indaziflam 6,0 302,2 138,1 80 70 10 125,1 80 70 10 Isotianil 4,8 297,0 154,0 200 70 10 153,0 200 70 10 151,9 200 70 10 91 200 70 10 Fluoxastrobin 7,1 459,0 427,1 80 70 10 188,0 80 70 10 Trifloxystrobin 9,2 409,1 186,1 80 70 10 206,1 80 70 10
47
2.3.5. Thẩm định xác định giá trị sử dụng của phƣơng pháp 2.3.5.1. Tính chọn lọc, đặc hiệu 2.3.5.1. Tính chọn lọc, đặc hiệu
Tính đặc hiệu: là khả năng phát hiện đƣợc chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác nhƣ các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tƣơng tự, tạp chất… Cụ thể, trong phép phân tích định tính đó là phải chứng minh đƣợc kết quả là dƣơng tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả phải là âm tính khi có mặt các cấu trúc khác gần giống chất phân tích. Trong phép phân tích định lƣợng là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hƣởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hƣớng đến kết quả chính xác. Tính đặc hiệu thƣờng liên quan đến việc xác định chỉ một chất phân tích.
Tính chọn lọc: Là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung một qui trình. Nếu chất cần xác định phân biệt rõ