1.3.2.1. Bộ phận phân tích khối phổ
Máy phân tích khối phổ hay chính xác hơn máy phân tích “tỉ lệ khối lƣợng theo điện tích (m/z) của ion “ là thiết bị phân tích dựa trên sự chuyển động của các ion trong môi trƣờng chân không „‟[16].
Các máy phân tích khối phổ thƣờng đƣợc phân loại tuỳ vào việc tách các ion mang điện theo phƣơng pháp nào. Ở đây ta chỉ xét thiết bị thông dụng là khối phổ tứ cực ( quadrupole mass spectrometer ). Để rõ đặc điểm của LC – MS/MS ( 2 lần khối phổ ) ta xét thiết bị LC- MS ( một lần khối phổ ) trƣớc
32
Hình 1.16: Mô hình thiết bị khối phổ MS ( LC-MS )
Phần quan trọng nhất là bộ lọc tứ cực (quadrupole mass spectrometer). Sự ion hoá mẫu xảy ra tại nguồn ion hoá. Các ion đƣợc phân tách bởi bộ tứ cực Q1 trƣớc khi tới detector [16].
Hình 1.17: Cấu tạo và hoạt động bộ tứ cực Trong đó :
- Source : Nguồn ion hóa
- Resonant ion : ion cộng hƣởng (ion đƣợc lựa chọn) - Nonresonnant ion : ion bị loại bỏ
- DC and AC voltages : Nguồn điện một chiều và xoay chiều áp lên bộ tứ cực Bộ tứ cực gồm 2 cặp thanh hình trụ đƣợc đặt song song với nhau một cách chính xác hai đầu đặt lên giá đỡ. Từng cặp thanh đối diện đƣợc nối điện với nhau. Điện xoay chiều áp lên cả 4 thanh nhƣng thanh gắn cực âm đối diện 180o với thanh gắn cực dƣơng. Các thanh mang điện + hay - phụ thuộc giá trị điện thế một chiều áp lên. Mỗi cặp thanh đối diện nhau chịu tác dụng dòng điện có tần số rất lớn 108 Hz và chiều điện áp trên mỗi thanh cũng thay đổi tƣơng ứng. Do ảnh hƣởng lực điện từ trƣờng các ion vừa di chuyển trong không gian nằm giữa các thanh trụ vừa dao động quanh trục tâm. Nhƣ vậy với mỗi giá trị điện áp đƣợc áp lên thì chỉ có những ion có tỷ số m/z thích hợp mới đi qua bộ tứ cực tới detecter. Khi ta chọn mảnh m/z đặc trƣng cho chất đƣợc nghiên cứu thì phần mềm chuyển tỷ số này thành sự thay đổi tần số và điện thế áp lên
33
bộ tứ cực để ion quan tâm có đƣợc dao động cộng hƣởng để di chuyển qua tứ cực và tới bộ phận ghi nhận tín hiệu[39].
Kỹ thuật MS một lần có một số nhƣợc điểm nhƣ : không nghiên cứu đƣợc cơ chế phân mảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, xác định thêm chi tiết cấu trúc hoá học, chịu ảnh hƣởng rõ rệt nền mẫu chất phân tích, do kỹ thuật ion hoá êm dịu nên khối phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử… [296].
Kỹ thuật MS/MS (2 lần) khắc phục đƣợc những điểm này đồng thời tăng thêm độ nhạy (cỡ fentogram ), tăng độ chính xác kết quả loại bỏ ảnh hƣởng của nền mẫu. Máy khối phổ MS – MS hay máy đo khối phổ hai lần liên tiếp gồm hai hệ máy khối phổ riêng biệt độc lập nhau đƣợc nối liền với nhau cách nhau bởi một buồng va chạm (collision cell). MS đầu tiên (tứ cực Q1) đƣợc sử dụng để cô lập ion sơ cấp (precursor ion), ion này liền ngay sau đó sẽ bị phân mảnh tại buồng va chạm collision cell để cho ra những ion thứ cấp (product ion) tiếp theo MS thứ hai (tứ cực Q2) sẽ phân tách những ion này. Những ion mong muốn sẽ đi tới detector và chuyển thành tín hiệu [16,17].
Hình 1.18: Mô hình thiết bị khối phổ MS/MS Trong đó :
- Rough pump : bơm chân không sơ cấp hút loại bỏ các chất không ở dạng ion nhƣ dung môi, các cấu tử bền không bị ion hóa…
34
- Turbo pump : bơm chân không thứ cấp tạo môi trƣờng chân không sâu 2,7–3,3.10-5 torr nhằm tránh sự phân mảnh ion do va chạm
- Collision cell : Nơi các ion bị phân mảnh do va chạm với khí N2 99.999%
1.3.2.2. Các nguồn ion hóa
Việc ghép sắc ký lỏng LC vào máy khối phổ MS không thể thực hiện trực tiếp đƣợc, vì muốn đo khối phổ cần phải tạo ra các ion ở thể khí, trong khi sắc ký lỏng đƣợc áp dụng cho các chất ít bay hơi. Vấn đề còn phức tạp thêm ở việc khi hợp chất đi ra khỏi cột sắc ký lỏng, hợp chất đó đang ở trong pha động lỏng, cần phải loại bỏ dung môi trƣớc khi đƣa hợp chất khảo sát vào MS.
Những sự không tƣơng thích cơ bản giữa hai loại kỹ thuật này là :
- Máy khối phổ MS hoạt động trong điều kiện chân không sâu, nhiệt độ cao, các chất khảo sát phải ở thể khí, vận tốc dòng chảy nhỏ….
- Máy sắc ký lỏng LC hoạt động trong điều kiện : áp suất cao, nhiệt độ tƣơng đối thấp, các chất khảo sát ở thể lỏng, vận tốc dòng chảy lớn…
Để khắc những khó khăn trong việc ghép HPLC và MS cần phải có kết nối chuyển đổi trung gian và kèm theo là các kiểu ion hoá ESI, APCI [17,29].
1.3.2.2.1. Chế độ ion hóa đầu phun điện tử (ESI)
Đầu phun điện tử (Electrospray Ionization: ESI) có cấu tạo nhƣ hình 1.19 [16].
Hình 1.19: Cấu tạo đầu phun ESI Trong đó :
- Nebulizing gas : Khí N2 (>99,5%) nén ở áp suất 60 psi đƣợc trộn hợp với dung môi pha động của HPLC tạo dạng sƣơng mù.
35
- Heated nitrogen drying gas : Khí N2 (>99,5%) đƣợc gia nhiệt 330oC tốc độ 5 lit/phút thổi khô, hóa hơi toàn bộ sƣơng mù.
- Capilary : Ống mao quản đƣợc áp thế 2,5 kV để hút các ion phân tử. Phụ thuộc dạng ion phân tử là positive/negative mà chiều điện trƣờng có chiều ngƣợc lại.
Trong kỹ thuật ESI, sắc ký lỏng đƣợc nối với ống mao quản làm bằng thép không gỉ, pha động (dung môi pha động có thêm chất điện ly ) kết hợp khí nén nitơ áp suất cao (60 psi) đƣợc phun sƣơng mù ra khỏi ống mao quản vào vùng có điện trƣờng mạnh (3-6 kV)ở nhiệt độ cao (trên 300oC).
Do ảnh hƣởng của nhiệt độ dung môi hoá hơi hoàn toàn và điện thế cao hỗn hợp chất cần phân tích chuyển thành ion phân tử và bị hút vào MS (Q1). Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dƣơng (ESI+) và ion âm (ESI-).
ESI là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao. Đây cũng là nguồn ion hóa mà đề tài lựa chọn để phân tích HCBVTV
1.3.2.2.2. Chế độ ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI)
Ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization : APCI) hoạt động theo nguyên tắc sau: Hoạt chất cần phân tích trong pha động sau khi qua khỏi cột sắc ký HPLC, qua ống mao quản kết hợp khí trơ ở áp suất cao (60psi). Khi ra khỏi ống mao quản pha động chuyển thành dạng sƣơng mù. Các hạt sƣơng nhỏ đƣợc khí gas ở nhiệt độ cao hoá hoàn toàn thành thể khí. Ở áp suất khí quyển, tại đầu que phóng điện Corona (đặt điện áp rất lớn 3- 6 kV) tập chung điện trƣờng rất mạnh các cấu tử xảy ra sự ion hoá hoá học (hình 1.21)[16].
36
Tại đây có sự trao đổi proton để thành ion dƣơng ( M+H )+ và trao đổi electron hoặc proton để biến thanh ion âm (M-H)-. . Do điện áp cao 2500 V các ion đƣợc hút vào capillary và đi tới bộ phận phân tich khối phổ [16,17].
Với dòng máy Agilent 6410 Triple Quad LC-MS/MS hỗ trợ cả hai dạng ion hoá ESI và APCI trên cùng một nguồn ion hoá .
Với nguồn ion hóa đa chế độ thì cả 2 chế độ ion hóa ESI và APCI đều đƣợc xây dựng. Điều này rất thuận tiện vì các hoạt chất khác nhau phù hợp với từng kiểu ion hóa mà không cần thay đổi nguồn ion hóa. Tuy nhiên quá trình bảo trì, vệ sinh làm sạch trở nên phức tạp và độ nhậy thiết bị giảm xuống so với từng nguồn ion hóa riêng biệt
1.4. Phƣơng pháp QuEChERS phân tích đa dƣ lƣợng thuốc BVTV
Năm 2003, Anastassiades và cộng sự [20, 21] giới thiệu một phƣơng pháp mới để phân tích dƣ lƣợng HCBVTV, sau này đƣợc gọi là phƣơng pháp QuEChERS (viết tắt của quick – nhanh, easy – dễ, cheap – rẻ, effective – hiệu quả, rugged - ổn định và safe – an toàn). QuEChERS là một phƣơng pháp phân tích đa dƣ lƣợng thuốc trừ sâu trong nhiều loại nền mẫu khác nhau, chỉ cần có khoảng 70 – 100% nƣớc trong thành phần (mẫu khô đƣợc cho thêm nƣớc). Nhƣ tên gọi của nó, chuẩn bị mẫu theo QuEChERS có nhiều thuận lợi so với các phƣơng pháp truyền thống khác mà vẫn đảm bảo kết quả phân tích. Phƣơng pháp QuEChERS ban đầu đƣợc báo cáo đầu tiên năm 2002 tại hội nghị phân tích dƣ lƣợng Châu Âu bởi Anastassisdes, Lehotay và cộng sự. Năm 2003, Lehotay và các cộng sự [38] nghiên cứu thẩm định phƣơng pháp này cho thấy phƣơng pháp này cho kết quả tốt với 207 chất trong số 235 thuốc trừ sâu trên các nền mẫu rau xà lách, nho và cam; tuy nhiên những chất nhạy với pH bị ảnh hƣởng rõ rệt. Sau đó Lehotay và cộng sự [38] thay đổi phƣơng pháp gốc bằng cách sử dụng đệm acetat pH 4,8-5,0 để tăng độ thu hồi của thuốc trừ sâu. Phƣơng pháp này sau đó đã đƣợc nghiên cứu thí nghiệm liên phòng trong 13 phòng thí nghiệm ở 7 quốc gia đối với 30 thuốc trừ sâu trên nền mẫu và trở thành phƣơng pháp chính thức của AOAC 2007.01 [22] vào năm 2007. Cùng thời gian đó, Anastassiades và cộng sự ở Stuttgart, cũng phát triển một phƣơng pháp QuEChERS khác sử dụng đệm citrat ở pH 5. Phƣơng pháp này đã đƣợc thẩm định liên phòng ở nhiều phòng thí nghiệm ở Đức và năm 2008 trở thành phƣơng pháp châu Âu EN 15662 [40].
37
1.5. Phƣơng pháp QuEChERS EN15662
Đầu tiên Michelangelo Anastassiades [32] đề xuất quy trình QuEChERS nhƣ sau:
- Giai đoạn xử lý mẫu : Mẫu nông sản ban đầu (cách lấy mẫu tùy thuộc vào đối tƣợng và theo hƣớng dẫn phòng thí nghiệm hoặc theo quy định quản lý cấp cao hơn ) đƣợc xử lý sơ bộ nhƣ : loại bỏ phần đất, sỏi ... không liên quan. Sau đó mẫu đƣợc nghiền nhỏ, mịn (lý tƣởng là đƣợc nghiền trạng thái đông lạnh) để giảm tối đa sự khác biệt trong một mẫu và tăng tối đa bề mặt tiếp xúc cho quá trình chiết. Với những mẫu thô nhƣ hoa quả thì đƣợc cắt ở kích cỡ < 3x3 cm sau đó mới đem đồng nhất mẫu. Sau khi đồng nhất mẫu đƣợc cân một lƣợng phù hợp để phân tích ngay hoặc bảo quản nhiệt độ < -20o
C.
- Cân 10 – 15 gam/mẫu vào ống tuyp ly tâm loại 50ml có nắp kín. Với mẫu có hàm lƣợng nƣớc thấp nhƣ chè, gạo, ngũ cốc thì cần thêm nƣớc vào để hàm lƣợng nƣớc > 75% để trong 2 h.
- Thêm 10 ml axetonitril (ACN) rung lắc mạnh khoảng 2 – 3 phút. Sau đó thêm MgSO4, NaCI, hỗn hợp muối đệm xitrat Na3C6H5O7và Na2C6H6O7 sao cho pH mẫu đạt 5 -5,5 [32].
- Rung lắc mạnh 2-3 phút và ly tâm 3000vòng/phút trong 5 phút để pha hữu cơ đƣợc phân tách. Thu pha hữu cơ và thêm các chất hấp phụ amin nhƣ PSA, than hoạt tính (GCB) để làm sạch loại bỏ cơ chất thực vật, chất diệp lục. Tiến hành ly tâm lần nữa, thu lấy pha hữu cơ đem thổi khô bằng khí N2 . Tùy thuộc thiết bị phân tích là hệ GC-MS/FPD/µECD hay HPLC-MS/MS mà định mức bằng dung môi thích hợp [37].
Hiện nay để thuận tiện trong chiết tách ngƣời ta đóng gói sẵn hỗn hợp muối vô cơ, muối đệm, chất làm sạch (PSA, GCB) thành những bộ kit (dạng dung dịch hoặc dạng bột rất mịn). Hiển nhiên tùy theo đối tƣợng nông sản và hoạt chất pesticide quan tâm mà thành phần mỗi bộ kit là khác nhau. Chính vì có nhiều hoạt chất và nhiều loại nông sản khác nhau mà hiện nay tồn tại nhiều quy trình khác nhau.
38
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu là 7 hóa chất bảo vệ thực vật gồm: Sulfoxaflor, Indaziflam, Isotianil, Cyantraniliprole, Chlorantraniliprole, Trifloxystrobin, Fluoxastrobin.
Các loại nông sản nhƣ: Dƣa hấu, Cà chua, Bắp cải, Thanh long, Chè, Nhãn, Dƣa chuột.
2.1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Mục tiêu chung của đề tài là nghiên cứu phƣơng pháp xác định đồng thời 7 HCBVTV nông sản bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ - khối phổ LC/MS/MS với 3 mục tiêu cụ thể nhƣ sau:
- Khảo nghiệm hiệu lực của các loại thuốc BVTV sau (bảng 2.1)
Tên thuốc Hoạt chất Dịch hại Cây trồng Địa điểm Closer 500WG Sulfoxaflor Bọ phấn (Bemisia tabaci) Cà chua Ninh Bình Thái Bình Rountine 200SC Isotianil Thối nhũn (Erwinia caratovora) Bắp cải Bắc Giang Vĩnh Phúc Becano 500SC Indaziflam Cỏ(Commelina
communis)
Chè Vĩnh Phúc Hòa Bình Evito-C 660SC Fluoxastrobin Đốm nâu
(Neoscytalidiu m dimidiatum) Thanh long Thái Nguyên Vĩnh Phúc Dupont Benevia 100OD Cyantranilipole Bọ trĩ (Thrips palmi) Dƣa chuột Thái Bình Ninh Bình Nativo 750WG Trifloxystrobin Đốm đen quả
(Collectotrichu m sp)
Nhãn Hòa Bình Thái Nguyên Voliam Targo Chlorantraniliprole Rệp (Aphids Dƣa hấu Bắc Giang
39
63SC gossyii Glover) Ninh Bình Bảng 2.1. Khảo nghiệm hiệu lực các loại thuốc BVTV
- Xây dựng phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng một số hóa chất bảo vệ thực vật nông sản, bao gồm:
Khảo sát các điều kiện phân tích
Thẩm định phƣơng pháp đã xây dựng
- Áp dụng phƣơng pháp để phân tích hóa chất bảo vệ thực vật trong nông sản miền Bắc Việt Nam, từ đó xác đinh thời gian cách ly – PHI
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.1. Chuẩn bị dung môi pha động và dung dịch chuẩn
- Chuẩn bị dung môi pha động
Dung dịch kênh A: ACN/H2O 2+8 (v/v) + 5mM CH3COONH4: Cân 0,385g CH3COONH4 vào bình định mức 1L, thêm 200ml ACN, định mức tới vạch bằng nƣớc cất 2 lần khử ion, lắc kỹ, siêu âm 15 min.Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 m trƣớc khi đƣa vào hệ thống HPLC-MS/MS.
Dung dịch kênh B: ACN/H2O 9+1 (v/v) + 5mM CH3COONH4: Cân 0,385g CH3COONH4 vào bình định mức 1L, thêm 900ml ACN, định mức tới vạch bằng nƣớc cất 2 lần khử ion, lắc kỹ, siêu âm 15 min.. Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 m trƣớc khi đƣa vào hệ thống HPLC-MS/MS.
- Chuẩn bị dung dich chuẩn
+ Dung dịch chuẩn gốc – 1000 µg/ml
Cân khoảng 0,01g các chất chuẩn chính xác tới 0,00001g vào bình định mức 10 ml, hoà tan và định mức tới vạch bằng axetonitril đƣợc dung dịch chuẩn gốc.
Chú ý: Do chất chuẩn bảo quản ở - 20oC nên phải đƣa về nhiệt độ phòng trƣớc khi cân. Dung dịch chuẩn sau khi pha bảo quản ở 0 -5 o
C
+ Dung dịch chuẩn làm việc
Bằng cách pha loãng liên tục và định mức bằng hồn hợp dung môi pha động và ACN đƣợc các mức nồng độ chuẩn làm việc 10, 20, 40, 80, 160 ng/ml.
40
2.2.2. Các hoá chất khác
Các loại hóa chất dùng trong phƣơng pháp phân tích đều thuộc loại hóa chất tinh khiết phân tích (P.A.) gồm :
- Chất chuẩn Sulfoxaflor, Isotianil, Indaziflam, Cyantraniliprole, Chlorantraniliprole, Trifloxystrobin, Fluoxastrobin.
- Formic acid
- Methanol (MeOH) - Acetonitril ACN - Sodium chloride NaCl
- Magnesium sulfate heptahydrate MgSO4..7H2O (nung 550oC trong 8 giờ, để nguội, cho vào bình đậy kín, bảo quản trong binh hút ẩm)
- Sodium hydrogencitrate sesquihydrate (C6H5Na2O7.1.5H2O) - Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7.2H2O)
- Amoni acetat (CH3COONH4)
- Primary secondary amine (PSA) kích thƣớc hạt 40-60 µm - Nƣớc trao đổi ion
2.2.3. Dụng cụ
- Bình định mức dung tích 10ml±0,04 ; 20ml±0,04 ; 50ml±0,06 - Ống đong dung tích 1000ml
- Ống ly tâm, có nắp xoáy dung tích 15ml, 50 ml - Pipet loại 1ml±0,01; 2ml±0,01; 10ml±0,05 - Micropipet 50-200 μl
- Ống đựng mẫu chiết 2,0 ml
2.2.4. Thiết bị
- Máy sắc kí lỏng khối phổ LC-MS/MS 6410MS (Agilent) - Cột Zorbax SB18 150mm x 4,6mm, 5µm
- Máy sắc ký lỏng HPLC 1100 (Agilent) - Cột Zorbax SB C18 250mm x 4,6mm, 5µm
- Cân phân tích có độ chính xác đến 0,00001 g - Cân kỹ thuật có độ chính xác đến 0,1 g
41
- Máy ly tâm Rotina 38R buồng lạnh 5 – 40oC, tốc độ ly tâm 1000 – 15000 vòng/phút
- Máy Vortex Genie 2TM điều chỉnh tốc độ lắc - Máy đo pH: pH Meter 744
- Máy siêu âm Sonorex Super RK514BH kết hợp gia nhiệt bể siêu âm, thời gian siêu âm tùy biến (1-15 phút)
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Khảo sát điều kiện khảo nghiệm
Tiến hành khảo sát địa điểm khảo nghiệm ở các tỉnh thuộc miền Bắc Việt Nam,