Phƣơng pháp phân tích sau khi đã chuẩn hóa đƣợc ứng dụng để phân tích lƣợng tồn dƣ HCBVTV trong các rau,quả khác nhau.
Dƣ lƣợng là lƣợng hoạt chất thuốc BVTV, dẫn xuất và các sản phẩm chuyển hóa của thuốc BVTV có độc tính còn lƣu lại trong nông sản hàng hóa và môi trƣờng sau khi sử dụng thuốc BVTV. Thời gian cách ly (Pre-harvest Interval – PHI) là khoảng thời gian tối thiểu kể từ ngày sử dụng thuốc BVTV lần cuối cùng đến ngày thu hoạch
65
sản phẩm trong quá trình trồng trọt hoặc thời gian tối thiểu từ khi sử dụng thuốc BVTV lần cuối đến khi sử dụng sản phẩm trong quá trình bảo quản. Để khảo nghiệm thời gian cách ly (PHI) chúng tôi lấy mẫu ở các thời điểm sau xử lý 2 giờ, 3, 7, 8 ngày sau xử lý.
Trong quá trình xử lý chúng tôi tiến hành phân tích lặp lại 2 lần lấy kết quả trung bình, kết hợp với các mẫu QC để đảm bảo chất lƣợng kết quả phân tích. Với những mẫu cao vƣợt khoảng tính toán thì pha loãng để kết quả luôn nằm trong khoảng định lƣợng đã khảo sát.
Hình 3.10: Diễn biến dƣ lƣợng thuốc BVTV (hoạt chất Sulfoxaflor) trên cây cà chua ở 2 vùng địa lý khác nhau
Kết quả phân tích dƣ lƣợng thuốc tại một số thời điểm trên cây trồng (bảng 3.17; 3.18 phụ lục 2 và hình 3.15; 3.19) cho thấy:
- Đối với chè, vì HCBVTV dùng để trừ cỏ, trong quá trình phun thuốc có thể phun phải cây trồng, tuy nhiên, sau khi thu hoạch, mẫu chè cần đƣợc sao khô, trong quá trình này có thể mất đi dƣ lƣợng HCBVTV. Vì vậy, khi phân tích không phát hiện dƣ lƣợng thuốc BVTV
- Dƣ lƣợng các mẫu còn lại đều ở dƣới mức giới hạn tối đa cho phép ở 7 và 8 ngày sau phun thuốc.(bảng 3.18, phụ lục 2)
66
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Đề tài “Nghiên cứu xác định dƣ lƣợng và hiệu lực các hoạt chất thuốc BVTV mới đƣợc sử dụng trên nông sản của miền Bắc Việt Nam” đã thu đƣợc các kết quả sau: - Kết quả đánh giá hiệu lực sinh học cho thấy: 7 loại thuốc BVTV trong nghiên cứu có hiệu lực tốt đối với cây trồng, sau xử lý, không thấy hiện tƣợng ngộ độc trên cây. - Đã khảo sát và chọn đƣợc các thông số tối ƣu cho quá trình chạy sắc ký: cột tách Cột Zorbax SB18 150mm x 4,6mm, 5µm, tỷ lệ kênh A : kênh B = 65: 34 (5 mM CH3COONH4) và tốc độ dòng là 0,6 ml/phút.
Phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm đã đƣợc khảo sát để tìm điều kiện tối ƣu cho chế độ ESI– posetive – MS/MS, độ ổn định cao.
- Đã ứng dụng và cải tiến thành công phƣơng pháp QuEChERS cho phân tích đa dƣ lƣợng theo hƣớng sử dụng ít dung môi hữu cơ độc hại, tăng hiệu quả phân tích, giảm giá thành. Thay đổi quy trình xử lý mẫu bằng 5% acid formic phù hợp với mẫu phân tích, cho hiệu suất thu hồi trên 80%.
- Tiến hành đánh giá và xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp phân tích cho thấy: LOQ = 0,01 (mg/kg), %Recovery = 80-115%, RSD% < 7 chothấy phƣơng pháp xây dựng đƣợc có độ lặp tốt, hiệu suất thu hồi cao hoàn toàn đáp ứng đƣợc cho những nông sản.
- Khảo nghiệm thời gian cách ly cho thấy sau 7 ngày phun lƣợng tồn dƣ của 7 loại HCBVTV trong rau đều nhỏ hơn LOQ, không vƣợt quá MRL (bảng 3.17) tại tất cả các liều lƣợng phun. Mỗi khảo nghiệm đƣợc thực hiện tại 2 vùng địa lý khác nhau, nhƣng kết quả phân tích gần giống nhau.
Kiến nghị :
- Tiếp tục mở rộng đối tƣợng nghiên cứu tăng số lƣợng HCBVTV trong một lần phân tích.
- Đối với các loại rau, quả, nếu sử dụng thuốc BVTV cần tuân thủ đúng thời gian cách ly.
- Phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng HCBVTV trên LC-MS/MS đã nghiên cứu cần nghiên cứu thêm về đánh giá độ không đảm bảo đo và tham gia thử nghiệm thành thạo.
67
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Bộ Nông nghiệp và PTNT. (1999), “Phương pháp lấy mẫu ki m định chất lượng và dư lượng thuốc BVTV” 10TCN 386-99 .
2. Bộ Nông nghiệp và PTNT. (2000), ”Khảo nghiệm trên đồng ruộng hiệu lực phòng trừ dòi đục lá hại rau các thuốc trừ sâu”, 10 TCN 415 - 2000.
3. Bộ Nông nghiệp và PTNT. (2015), “Danh mục các loại thuốc được phép sử dụng ở Việt am”, 2008.
4. Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn (2015), Thông tư số:21/2015/TTB PT T ngày 8 tháng 6 năm 2015 Ban hành danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng, hạn chế sử dụng, cấm sử dụng và danh mục bổ sung giống cây trồng được phép sản xuất, kinh doanh ở Việt am.
5. Cục Bảo vệ thực vật. (2004), “Qui định Khảo nghiệm xác định thời gian cách ly của thuốc BVTV đối với cây trồng” ban hành kèm theo Quyết định số 183/QĐ-BVTV ngày 15/3/2004.
6. Đào Văn Hoằng. (2005), Kỹ thuật tổng hợp các hóa chất bảo vệ thực vật, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
7. Lê Bá Thảo (Chỉnh sửa Hoàng Lan Tôn). 2001. “Việt Nam – Lãnh thổ và các vùng địa lý, NXB Thế Giới, Hà Nội.
8. Nguyễn Mạnh Chinh (2012), Cẩm nang thuốc bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
9. Phạm Hùng Việt. (2003), Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký khí, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
10. Phạm Luận (1999), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao, Trƣờng đại học Quốc gia Hà Nội.
11. PGS.TS. Nguyen Trần Oánh, TS. Nguyen Văn Viên , KS.Bùi Trọng Thủy. (2007), “Giáo trình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật”, Hà Nội.
12. Tạ Thị Thảo (2009), Giáo trình giảng dạy thống kê trong hoá phân tích, Trường ĐH Khoa học tự nhiên-ĐH Quốc gia Hà ội
68
13. Tổng cục tiêu chuẩn đo lƣờng chất lƣợng TCVN 6910 (2001), Độ chính xác (Độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tr 1-6.
14. TS. Hoàng Xuân Tiến (2013) Hóa học bảo vệ thực vật, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
15.Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2003) Hoá học phân tích - Phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
Tiếng Anh
16. AgilentTechnologies. (2006-2007) , Agilent 6410 Triple Quad LC/MS System
17. AgilentTechnologies. (2006), Agilent 6410 Triple Quad LC/MS Familiarization Guide
18. AgilentTechnologies. (2006), Automated Screening of 600 Pesticides in Food by LC/TOF MS Using a Molecular-Feature Database Search, 5989-5496EN
19. AgilentTechnologies QuEChERS Demo
20. Anastassiades, M., Lehotay, S.J., Stajnbaher, D., & Schenck, F.J. (2003), "Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and dispersive solid-phase extraction for the determination of pesticide residues in produce", Journal of AOAC International, 86(2), 412–431.
21. Anastassiades, M., Mastovska, K., & Lehotay, S.J. (2003), "Evaluation of analyte protectants to improve gas chromatographic analysis of pesticides", Journal of Chromatography A, 1015(1), 163–184.
22.AOAC International (1985), “AOAC Official Method 985.22 Organochlorine and Organophosphorus Pesticide Residues - Gas Chromatographic Method” AOAC Official method.
23. AOAC International (1988), “AOAC Official Method 998.01 Synthetic Pyrethroids in Agricultural Products - Multiresidue Gas Chromatographic Method”
AOAC Official method.
24 AOAC International (2012), “AOAC Official Method 2007.01 – Pesticide residues in foods by acetonitrile extraction and partitioning with magnesium sulfate” Official Method of Analysis of AOAC International, 19th edition, AOAC, USA.
69
25. AOAC International (2012), “AOAC Official Method 985.22 – Organochlorine and organophosphorus pesticide residues gas chromatographic”, Official Method of Analysis of AOAC International, 19th edition, AOAC, USA.
26. AOAC International (2012), “ Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements”, Official Method of Analysis of AOAC International, 19th edition, AOAC, USA.
27. Angelika, Gratzfeld-Husgen and Rainer Schuster. (2001), HPLC for Food Analysis, Germany, Publiccation Number 5988-3294EN, 101 – 105
28. CDS Tamlin. 2003, The Pesticide Manual Third Edition, Harcourt College Publishers, NewYork pp 508-509.
29. Donal L. Pavia, Gary M. Lampman, Georges S. Kriz. (2001), Introduction to spectrometry. A guide for student of organic chemistry, Harcourt College Publishers, NewYork, London, Tokyo
30. Dr. Tuija Pihlström, Dr. Michelangelo Anastassiades, Mr. Arne Andersson, Dr. André de Kok, Dr. Mette Erecius Poulsen, Dr. Amadeo R. Fernández-Alba. (2009),
Method Validation and quality control procedure for pseticide residue analysis in food and feed, Document No. SANCO/10684/2009,
31. European Commission (2002), “2002/657/EC: Commission Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results”.
32. EN 15662 (2008), Food of plant origin – Determination of pesticide residues using GC-MS and/or LC-MS/MS following acetonitrile extraction/patitioning and cleanup buy dispersive SPE – QuEChERS – method.
33. Environmental Protection Agency. (1995). http://www. EPA. Gov
34. Food and Agriculture Organization of the United Nations (2002), International Code of Conduct on the Distribution and Use of Pesticides
35. Frederick M. Garfiled, Eugenne Klesta, Jerry Hirsch. (2000), Quality assurace principles for analytical laboratories, USA.
36. Huanpu E. Deen P.E. (2008), Quality Muanual and Quality Procedures for ANSI/ISO/IEC 17025,Harcourt College Publishers, NewYork, 38-40
37. Kim A. Anderson, Ph.D. (1999), Analytical Techniques for Inorganic Contaminants, USA.
70
38.Lehotay S.J. (2007), J. AOAC. Int. 90, 485 – 520.
39. Marvin McMaster and Chiristopher MsMaster. (1998), GC/MS A Practical User‟s Guide, United States of Amerrica, 40 -50
40. Michelangelo Anastassiades, CVUA Stuttgart. (2003), QuEChERS - A Mini- Multiresidue Method for the Analysis of Pesticide Residues in Low-Fat Products.
41. Newzealand food safety authority. (1999), Maximum residue limits (MRLs) for specified AgricultAral compound in food. Proposed amendment to the Newzeland (MRL of agricultural compounds) mandatory food standard, 1999.
42. T. Visser, M J Verdenbregt and A.P J Mde Jong, L.A. van Ginkel, H.J. vanRossurn and R.W. Stephany. Cryotrapping gas chromatography – fourier trasform infrared spectrometry: anew technique to confirm the presence of beta – agonists in animal material. Analytica Chumuca Acta, 275, 205-214.
43. Tethgatuk P., Jinsart W. and Arnold P. (2001), Determination of Organophosphate Pesticides in Vegetable Farm Drained Water Using Solid Phase Extraction Followed by High Performance Liquid Chromatography, J. Sci. Res. Chula. Univ, Vol. 26 No. 1, 35-47
44. Reigart, J.R., & Roberts J.R. (1999), Recognition and Management of Pesticide Poisonings, 5thedition, United State Environmental Protection Agency, Washington DC.
71
PHỤ LỤC Phụ lục 1: Số liệu khảo nghiệm sinh học
Bảng 3.10: Mật độ bọ phấn hại cà chua (con/lá) trƣớc và sau khi xử lý thuốc Ngày xử lý NTXL 1NSXL 3NSXL 7NSXL
Xử lý 4,58 2,19 1,28 0,27 Đối chứng 4,93 5,51 6,14 7,19 Hiệu lực(%) 63,07 91,71 99,21 Bảng 3.11: Tỉ lệ bệnh thối nhũn hại bắp cải (%) trƣớc và sau khi xử lý thuốc
Ngày xử lý NTXL 1NSXL 3NSXL 7NSXL Xử lý 1 1,3 1,5 1,5 Đối chứng 1 2 4 7 Bảng 3.12: Tỉ lệ bệnh đốm nâu hại thanh long(%) trƣớc và sau khi xử lý thuốc
Ngày xử lý NTXL 1NSXL 3NSXL 7NSXL Xử lý 6,69 8,19 8,72 8,72 Đối chứng 6,46 17,41 19,91 20,91 Bảng 3.13: Khối lƣợng cỏ (g/m2) trƣớc và sau khi xử lý thuốc
Ngày xử lý NTXL 1NSXL 3NSXL 7NSXL Xử lý 6,69 8,19 8,72 8,72 Đối chứng 6,46 9,5 13 19,5
Bảng 3.14: Mật độ bọ bọ trĩ hại dƣa chuột (con/ngọn) trƣớc và sau khi xử lý thuốc Ngày xử lý NTXL 1NSXL 3NSXL 7NSXL
Xử lý 8,39 4,16 2,04 0,37 Đối chứng 7,33 8,41 9,38 10,87 hiệu lực % 56,81 81,04 97,03 Bảng 3.15: Tỉ lệ bệnh đốm đen quả hại nhãn (%) trƣớc và sau khi xử lý thuốc
Ngày xử lý NTXL 1NSXL 3NSXL 7NSXL Xử lý 5,66 6,21 7,38 9,33 Đối chứng 4,93 12,57 16,22 20,47
72
Bảng 3.16: Mật độ rệp hại cây dƣa hấu (con/lá) trƣớc và sau khi xử lý thuốc Ngày xử lý NTXL 1NSXL 3NSXL 7NSXL
Xử lý 8,34 4,57 3,67 3,4 Đối chứng 8,44 17,76 21,81 25,19 Hiệu lực(%) 74 83 86,35
Ghi chú : - NXL: Ngày sau phun - NSXL: Ngày sau xử lý
Hình 3.11. Tỉ lệ % bệnh đốm nâu (Neoscytalidiu m dimidiatum) hại thanh long trong thời gian khảo nghiệm
Hình 3.12. Mật độ cỏ (Commelina communis) (g/m2) trên chè trong thời gian khảo nghiệm
73
Hình 3.13. Mật độ bọ trĩ (Thrips palmi) hại cây dƣa chuột trong thời gian khảo nghiệm
Hình 3.14. Tỉ lệ % bệnh đốm đen quả (Collectotrichum sp) hại cây nhãn trong thời gian khảo nghiệm
74
Hình 3.15. Tỉ lệ rệp (Aphids Gossyii Glover) hại cây dƣa hấu trong thời gian khảo nghiệm
75
Phụ lục 2 : Số liệu phân tích PHI
Bảng 3.17: Kết quả xác định dƣ lƣợng thuốc trên cây trồng
TT
Công thức xử lý Dư lượng HCBVTV sau xử lý
Công thức Nồng độ xử lý Địa điểm 2 giờ 3 ngày 7 ngày 8 ngày
1 Closer 500WG (Cà chua) 150 g/ha Ninh Bình 1,79 0,38 <LOQ <LOQ Thái Bình 1,83 0,41 <LOQ <LOQ 2 Rountine 200SC(Bắp cải) 0,4l/ha Bắc
Giang 0,50 0,14 <LOQ <LOQ Vĩnh
Phúc 0,56 0,11 <LOQ <LOQ
3 Becano 500SC 0,15l/ha
Vĩnh
Phúc <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ Hòa Bình <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ
4 Evito-C 660SC(Thanh long) 0,5% Thái
Nguyên 0,73 0,18 <LOQ <LOQ Vĩnh Phúc 0,74 0,16 <LOQ <LOQ 5 Dupont Benevia 100OD (Dƣa chuột) 1,25 l/ha Thái Bình 1,15 0,31 <LOQ <LOQ Ninh Bình 1,26 0,35 <LOQ <LOQ 6 Nativo 750WG(Nhãn) 0,25% Hòa Bình 1,17 0,62 0,08 <LOQ Thái Nguyên 1,28 0,57 0,11 <LOQ 7 Voliam Targo 63SC (Dƣa hấu) 0,3l/ha Ninh Bình 1,91 0,27 <LOQ <LOQ Bắc
Giang 1,89 0,24 <LOQ <LOQ
8 Đối chứng Phun
76
Bảng 3.18. Mức dƣ lƣợng tối đa cho phép áp dụng trên các đối tƣợng cây trồng HCBVTV Cây trồng MRL
Sulfoxaflor Cà chua 1,5 - Codex
Isotianil Bắp cải LOQ (phƣơng pháp) Indaziflam Chè LOQ (phƣơng pháp) Fluoxastrobin Thanh long LOQ (phƣơng pháp) Cyantraniliprole Dƣa chuột 0,3 EU
Chlorantraniliprole Nhãn 0,3 - Đài Loan Trifloxystrobin Dƣa hấu 0,5 - Đài Loan
Hình 3.16. Diễn biến dƣ lƣợng thuốc BVTV (hoạt chất Isotianil) trên rau bắp cải ở 2 vùng địa lý khác nhau
77
Hình 3.17. Diễn biến dƣ lƣợng thuốc BVTV (hoạt chất Fluoxastrobin) trên cây thanh long ở 2 vùng địa lý khác nhau
Hình 3.18. Diễn biến dƣ lƣợng thuốc BVTV (hoạt chất Cyantraniliprole) trên cây dƣa chuột ở 2 vùng địa lý khác nhau
78
Hình 3.19. Diễn biến dƣ lƣợng thuốc BVTV (hoạt chất Trifloxystrobin) trên cây nhãn ở 2 vùng địa lý khác nhau
Hình 3.20. Diễn biến dƣ lƣợng thuốc BVTV(hoạt chất Cyantraniliprole) trên cây dƣa hấu ở 2 vùng địa lý khác nhau
79
Phụ lục 3 : Một số sắc ký đồ phân tích mẫu
HÌnh 3.21. Sắc ký đồ EIC và phổ khối của Sulforxaflor ở nồng độ 10 ng/ml
80
HÌnh 3.23. Sắc ký đồ EIC và phổ khối của Cyantrraniliprole ở nồng độ 10 ng/ml
81
Hình 3.25.Sắc ký đồ EIC và phổ khối của Indaziflam ở nồng độ 10 ng/ml
82
Hình 3.27.Sắc ký đồ EIC và phổ khối của Trifloxystrobin ở nồng độ 10 ng/ml
Phụ lục 4. Một số đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng trong nghiên cứu
83
Hình 3.29.Đƣờng chuẩn Chlorantraniliprole
84
Hình 3.31. Đƣờng chuẩn Isotianil
85
Hình 3.33. Đƣờng chuẩn Fluoxastrobin
86
Phụ lục 5: Bảng số liệu độ lặp lại của thiết bị
Bảng 3.19. Độ lặp lại của thiết bị tại nồng độ Chlorantraniliprole 10 ng/ml
Dung dịch đo Thời gian lƣu Diện tích píc Nồng độ tìm đƣợc S/N ACN Chlorantraniliprole 10 ng/ml 5.408 644.56 9.475 26.71 Chlorantraniliprole 10 ng/ml 5.389 654.24 9.784 22.18 Chlorantraniliprole 10 ng/ml 5.426 648.08 9.506 24.45 Chlorantraniliprole 10 ng/ml 5.41 652.28 9.811 26.24 Chlorantraniliprole 10 ng/ml 5.396 668.85 10.025 23.56 STDEV 0.01 9.31 0.23 1.88 Giá trị trung bình 5.40 653.60 9.72 24.62 %RSD 0.26 1.42 2.36 7.62
Bảng 3.20. Độ lặp lại của thiết bị tại nồng độ Cyantraniliprole 10 ng/ml
Dung dịch đo Thời gian lƣu Diện tích píc Nồng độ tìm đƣợc S/N
ACN Cyantraniliprole 10 ng/ml 4.504 1031.43 10.168 11.18 Cyantraniliprole 10 ng/ml 4.496 1019.68 9.872 15.25 Cyantraniliprole 10 ng/ml 4.413 1058.47 10.482 14.38 Cyantraniliprole 10 ng/ml 4.448 1039.64 10.231 15.39 Cyantraniliprole 10 ng/ml 4.46 1020.25 9.899 12.88 STDEV 0.034 16.056 0.25 1.78 Giá trị trung bình 4.46 1033.89 10.13 13.81 %RSD 0.83 1.55 2.49 12.88
87
Bảng 3.21. Độ lặp lại của thiết bị tại nồng độ Isotianil 10 ng/ml
Dung dịch đo Thời gian lƣu Diện tích píc Nồng độ tìm đƣợc S/N
ACN Isotianil 10 ng/ml 4.809 5070.89 8.779 23.34 Isotianil 10 ng/ml 4.838 5118.46 8.915 20.18 Isotianil 10 ng/ml 4.624 5155.12 9.462 24.36 Isotianil 10 ng/ml 4.606 5030.11 8.564 24.85 Isotianil 10 ng/ml 4.617 5131.67 9.249 18.88 STDEV 0.11 50.26 0.361 2.64