2.3.2.1. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm
Tiến hành thí nghiệm ở diện rộng (1500m2), các ô đƣợc bố trí theo kiểu tuần tự.
- Diện tích mỗi ô đơn vị: 300m2 - Nhắc lại: 0 lần
- Các ô khảo nghiệm phải có hình vuông hay hình chữ nhật nhƣng chiều dài phải không vƣợt quá hai lần chiều rộng.
42
- Giữa các công thức khảo nghiệm phải có dải phân cách rộng ít nhất là 1 luống, 1 hàng cây đối với cây ăn quả (thanh long, nhãn)
Bảng 2.2: Công thức thí nghiệm khảo nghiệm thuốc BVTV
STT Tên thuốc khảo nghiệm Dịch hại/Cây trồng
Liều lƣợng Thời điểm xử lý
1 Closer 500WG
Bọ phấn/Cà chua
150 g/ha Thuốc đƣợc phun 1 lần khi dƣa chuột bị bọ phấn xuất hiện gây hại, mật độ
3-5 con/lá 2 Rountine 200SC Thối nhũn/Bắp cải 0,4l/ha Thuốc đƣợc xử lý phòng trƣớc khi bênh xuất hiện(khoảng 40
ngày sau khi ra ngôi) 3 Becano
500SC
Cỏ/chè 0,15l/ha Thuốc đƣợc xử lý một lần khi làm đất sạch, khi đất đã sạch cỏ. 4 Evito-C 660SC Đốm nâu/Thanh long
0,5% Lần đầu khi bệnh chớm xuất hiện, tỷ lệ khoảng 5-10% 5 Dupont benevia 100OD Bọ trĩ/Dƣa chuột
1,25l/ha Thuốc đƣợc phunkhi bọ trĩ mới xuất hiện, mật độ khoảng
2-3 con /lá 6 Nativo
750WG
Đốm đen quả/Nhãn
0,25% Thuốc đƣợc phun 1 lần khi tỷ bệnh từ 4,93 -5,85 % 7 Voliam Targo 63SC Rệp/Dƣa hấu
0,3l/ha Thuốc đƣợc phun lần 1 khi mật độ rệp khoảng 8 con/lá. Phun
lần 2 cách lần đầu 7 ngày 8 Đối chứng Phun nƣớc lã -Lƣợng nƣớc thuốc: 400-500 lít/ha
- Dụng cụ phun: Bình bơm tay đeo vai
2.3.2.2. Chỉ tiêu và phƣơng pháp điều tra Chỉ tiêu điều tra : Chỉ tiêu điều tra :
- Xác định tỉ lệ bệnh, mật độ côn trùng trƣớc khi xử lý thuốc và 1,3,7 ngày sau xử lý
- Hiệu lực của thuốc ở các ngày sau xử lý
43
- Ảnh hƣởng của thuốc với cây ở 1,3,7 ngày sau xử lý theo Quy phạm khảo nghiệm trên đồng ruộng số 10 TCN415 – 2000 của Bộ Nông nghiệp và PTNT nhƣ sau:
Cấp triệu trứng nhiễm độc của cây trồng: 1 – Cây bình thƣờng
2 – Sinh trƣởng cây giảm nhẹ
3 – Ngộ độc tăng lên, sinh trƣởng của cây giảm nhƣng triệu chứng (màu sắc, hình dạng ...) chƣa rõ ràng.
4 – Có triệu chứng ngộ độc nhƣng chƣa ảnh hƣởng đến năng suất 5 – Cây biến màu thuốc gây ảnh hƣởng đến năng suất
6 – Thuốc làm giảm năng suất ít
7 – Thuốc gây ảnh hƣởng nhiều tới năng suất 8–Triệu chứng ngộ độc tăng dần tới làm chết cây 9 – Cây bị chết hoàn toàn
Phƣơng pháp điều tra:
- Đối với cà chua: Mỗi ô chọn 10 điểm trên 2 đƣờng chéo góc, mỗi điểm điều tra 20 lá, đếm số bọ phấn sống. Cố định các điểm trong thời gian khảo nghiệm
- Đối với bắp cải: Mỗi ô điều tra tại 10 điểm trên 2 đƣờng chéo góc, mỗi điểm điều tra 10 cây cố định. Các điểm điều tra cách mép ô khảo nghệm 0.5m.
- Đối với dƣa chuột: Mỗi ô chọn 10 điểm trên 2 đƣờng chéo góc, mỗi điểm chọn 2 ngọn (ngọn bao gồm 1 đọt non và 2 lá kế tiếp), Đếm số lƣợng bọ trĩ sống bằng kính lúp cầm tay.
- Đối với chè: Mỗi ô chọn 10 điểm trên 2 đƣờng chéo góc. Đếm toàn bộ số cỏ dại rồi phân thành các nhóm cỏ chính.
- Đối với thanh long: Mỗi ô khảo nghiệm theo dõi 3 nọc. Trên mỗi nọc theo dõi 4 cành cố định, đại diện cho 4 hƣớng. Mỗi cành theo dõi một đoạn cành dài 30cm. Quan sát và phân cấp mực độ bệnh ở cả 3 mặt của đoạn cành.
- Đối với nhãn: Mỗi ô chọn 6 cây ngẫu nhiên, môi cây điều tra tất cả các chùm quả trên 4 cành cố định ở 4 hƣớng của cây
44
2.3.3. Phƣơng pháp xử lý mẫu thu hoạch sau khảo nghiệm
Mẫu đƣợc lấy theo tiêu chuẩn lấy mẫu ngoài đồng ruộng TCVN 5139:2009, và đƣợc xử lý theo quy trìnhQuEChERS đã nghiên cứu:
- Cân 10 gam/mẫu đã đƣợc cắt nhỏ và đồng nhất vào ống tuyp ly tâm loại 50ml có nắp kín.
- Thêm 10 ml acetonitril (ACN) rung lắc mạnh khoảng 2 – 3 phút. Sau đó thêm 4 MgSO4, 1 g NaCI, hỗn hợp muối đệm citrat 1 g Na3C6H5O7 và 0,5 g Na2C6H6O7 , đo pH mẫu đạt 5 -5,5.
- Rung lắc mạnh 2-3 phút và ly tâm 3000vòng/phút trong 5 phút để pha hữu cơ đƣợc phân tách. Hút 4 ml pha hữu cơ và thêm các chất hấp phụ PSA, 1g MgSO4, lắc khoảng 30 giây. Tiến hành ly tâm lần nữa, thu lấy pha hữu cơ, thêm 5% axit fomic vào 2ml dịch chiết rồi phân tích bằng LC-MS/MS
45
Hình 2. 1: Quy trình phân tích mẫu
2.3.4. Điều kiện phân tích
2.3.4.1. Điều kiện phân tách trên hệ thống HPLC
Cột phân tích : ZORBAX SB RPC18 150mm x 4,6 mm, 5 m - Nhiệt độ cột : 400C
- Tốc dòng : 0,6 ml/phút - Thể tích bơm mẫu : 20 l
Chƣơng trình dung môinhƣ sau: tỷ lệ kênh %A: %B = 65: 35, trong thời gian 12 phút/ mẫu.
Mẫu (>1kg) đƣợc cắt nhỏ ra, lấy khoảng 200g mẫu đại diện và đồng nhất bằng thiết bị đồng nhất mẫu
Chuyển 10g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm 50ml Thêm 10ml ACN +1g Na3C6H5O7 .1,5 H2O + 1 g NaCl + 0,5 g
Na2C6H6O7. 2H2O +4 g MgSO4
Lắc mạnh trong khoảng 2-3 phút, sau đó ly tâm với tốc độ 3000 vòng /phút và trong 5 phút
Chuyển 4ml vào ống ly tâm 15ml trong đó đã có 100mg MgSO4+30 mg PSA/ml dịch chiết và lắc trong khoảng 30 giây
Ly tâm 3000 vòng/phút trong khoảng 5 phút
Chuyển 2 ml dịch chiết vào vial 2 ml và thêm 5% acid formic và lắc đều
46
2.3.4.2. Điều kiện phân tích trên hệ thống khối phổ ESI - MS/MS :
Nguồn ion hóa (ESI) áp dụng các thông số nhƣ bảng 2.3
Bảng 2.3: Các thông số của chế độ ion hóa ESI Nguồn ion hóa: ESI/ posetive/MRM Nhiệt độ khí N2: 300 oC
Lƣu lƣợng khí N2: 7 L/phút Áp suất đầu phun: 20 psi Điện áp mao quản: 4000 V
Chế độ quét MS/MS:MRM (SIM to SIM) với các thông số nhƣ bảng 2.4 Bảng 2.4: Các thông số chế độ quét MS/MS
Hoạt chất Thời gian lƣu (phút) Ion sơ cấp Ion thứ cấp Chu kỳ quét (ms) Điện áp phân mảnh (V) Năng lƣợng va chạm (V) Sulfoxaflor 3,47 278,0 174,0 80 70 10 154,0 80 70 10 Chlorantraniliprole 5,3 484,0 453,0 100 70 15 286,0 100 70 8 112,0 100 70 20 Cyantraniliprole 4,4 475,0 286,0 80 70 10 284,0 80 70 10 Indaziflam 6,0 302,2 138,1 80 70 10 125,1 80 70 10 Isotianil 4,8 297,0 154,0 200 70 10 153,0 200 70 10 151,9 200 70 10 91 200 70 10 Fluoxastrobin 7,1 459,0 427,1 80 70 10 188,0 80 70 10 Trifloxystrobin 9,2 409,1 186,1 80 70 10 206,1 80 70 10
47
2.3.5. Thẩm định xác định giá trị sử dụng của phƣơng pháp 2.3.5.1. Tính chọn lọc, đặc hiệu 2.3.5.1. Tính chọn lọc, đặc hiệu
Tính đặc hiệu: là khả năng phát hiện đƣợc chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác nhƣ các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tƣơng tự, tạp chất… Cụ thể, trong phép phân tích định tính đó là phải chứng minh đƣợc kết quả là dƣơng tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả phải là âm tính khi có mặt các cấu trúc khác gần giống chất phân tích. Trong phép phân tích định lƣợng là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hƣởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hƣớng đến kết quả chính xác. Tính đặc hiệu thƣờng liên quan đến việc xác định chỉ một chất phân tích.
Tính chọn lọc: Là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung một qui trình. Nếu chất cần xác định phân biệt rõ với chất khác thì phƣơng pháp phân tích có tính chọn lọc. Nhƣ vậy, tính chọn lọc có thể bao trùm cả tính đặc hiệu. Do các phƣơng pháp phân tích thƣờng có nhiều chất cùng xuất hiện nên khái niệm tính chọn lọc thƣờng mang tính khai quát hơn.
*Cách xác định:
Có nhiều cách xác định tính đặc hiệu, tính chọn lọc, trong nghiên cứu này do thiết bị sắc ký có gắn detecter MS nên chúng tôi so sánh phổ của chất phân tích trên 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn. Mẫu trắng không đƣợc lên tín hiệu chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lƣu tƣơng ứng thời gian lƣu trên mẫu chuẩn.
2.3.5.2. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng
Giới hạn phát hiện LOD: là nồng độ mà tại đó giá trị xác định đƣợc lớn hơn độ không đảm bảo đo của phƣơng pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện đƣợc nhƣng chƣa thể định lƣợng đƣợc.
Có nhiều các xác định LOD: dựa trên độ lệch chuẩn, dựa trên đƣờng chuẩn, dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu. Trong nghiên cứu này chúng tôi xác định LOD dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu đƣờng (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio).
trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích N là nhiễu đƣờng nền
48
LOD đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3).
Giới hạn định lượng LOQ: là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lƣợng bằng phƣơng pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn.
Có nhiều cách xác định LOQ trong nghiên cứu này chúng tôi cũng xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu S/N. LOQ đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10).
2.3.5.3. Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn
Khoảng tuyến tính của một phương pháp: là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đƣợc đo và nồng độ các chất phân tích.
Đường chuẩn: là đƣờng biểu diễn sự phụ thộc tuyến tính giữa đại lƣợng đƣợc đo và nồng độ các chất phân tích.
Để xác định khoảng tuyến tính chúng tôi thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi từ và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Sau đó vẽ đƣờng cong phụ thuộc giữa diện tích pic thu đƣợc vào nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính
Sau khi xác định đƣợc khoảng tuyến tính của các chất, chúng tôi đã xây dựng đƣờng chuẩn trên nền mẫu thực có sử dụng nội chuẩn, nhằm mục đích loại trừ ảnh hƣởng của nền mẫu đến kết quả phân tích. Nội chuẩn đƣợc thêm vào dung dịch chuẩn để đo máy, với nồng độ phù hợp và giống nhau. Vẽ đƣờng cong phụ thuộc giữa tỷ lệ tín hiệu chất ngoại chuẩn và chia cho nội chuẩn (trục tung y) phụ thuộc vào nồng độ ngoại chuẩn (trục hoành x).
2.3.5.4. Độ lặp lại (độ chụm) và độ thu hồi (độ đúng).
Hiện nay có nhiều cách khác nhau về thuật ngữ độ chính xác. Theo quan điểm mới nhất của tiêu chuẩn quốc tế (ISO 5725 1- 6:1994) và tiêu chuẩn quốc gia (TCVN 6910 1-6:2005) thì thuật ngữ độ đúng và độ chụm diễn tả độ chính xác của phƣơng pháp phân tích.
Độ chụm hay độ lặp lại là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại. Độ chụm là một khái niệm định tính và đƣợc biểu diễn định lƣợng bằng độ lệch chuẩn S hay hệ số biến thiên CV (%):
49 1 1 2 N x x S N i i (2-1) CV (%) = .100 x S (2-2) Trong đó: xi : Nồng độ tính đƣợc của lần thử nghiệm thứ i
x : Nồng độ trung bình tính đƣợc của N lần thử nghiệm. N : Số lần thử nghiệm.
Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực hoặc giá trị đƣợc chấp nhận. Độ đúng là khái niệm định tính và đƣợc biểu diễn định lƣợng dƣới dạng độ chệch (Bias) hoặc hiệu suất thu hồi (recovery)
R(%) = C
Cc .100 (2-3) Trong đó:
R: độ thu hồi (%)
C : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn (ng/ml). Cc : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ng/ml).
Để xác định độ chụm và độ đúng của phƣơng pháp phân tích, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nhƣ sau: Tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau (mỗi mức làm lặp lại 10 lần) và tính toán kết quả theo công thức trên.
50
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định hiệu lực sinh học của thuốc đối với cây trồng
3.1.1. Tỉ lệ bệnh, mật độ côn trùng trƣớc và sau khi xử lý thuốc
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thuốc đối với côn trùng, bệnh gây hại đến cây trồng (hình 3.1,3.2 và các hình 3.10-3.14 ,bảng số liệu phụ lục 1).
Hình 3.1. Mật độ bọ phấn (Bemisia tabaci) trên cà chua trong thời gian khảo nghiệm
Hình 3.2 . Tỉ lệ % bệnh thối nhũn (Erwinnia caratovora) trên bắp cải trong thời gian khảo nghiệm
51
* Ảnh hưởng của thuốc đối với cây trồng ở các ngày sau xử lý thuốc
Cây trồng Cấp hại 1NSXL 3NSXL 7NSXL Cà chua 1 1 1 Bắp cải 1 1 1 Chè 1 1 1 Thanh long 1 1 1 Dƣa chuột 1 1 1 Nhãn 1 1 1 Dƣa hấu 1 1 1
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của thuốc đối với cây trồng ở các ngày sau xử lý thuốc Kết quả thống kê bảng 3.1,3.10 – 3.18 và hình 3.2,3.3 và các hình 3.10 – 3.14 cho thấy:
- Tất cả các thuốc đều có hiệu lực ngay sau khi phun thuốc. Cụ thể nhƣ, mật độ côn trùng giảm rõ rệt ngay sau phun 1 ngày, tỉ lệ bệnh trên cây không còn tăng so với tỉ lệ bệnh ở ô đối chứng.
- Không có biểu hiện ngộ độc cây rau ở tất cả các ô công thức thí nghiệm
3.2. Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp phân tích dƣ lƣợng 7 HCBVTV
3.2.1. Tối ƣu hoá các điều kiện đo trên thiết bị HPLC – MS/MS 3.2.1.1. Khảo sát các điều kiện hệ thống HPLC 3.2.1.1. Khảo sát các điều kiện hệ thống HPLC
Chọn điều kiện bơm mẫu
Với hệ thống HPLC – MS/MS 6410MS (Agilent), bộ phận bơm mẫu là tự động (Auto Sampler). Mẫu đã chuẩn bị nạp vào ống 2ml đặt trong khay, sau đó cánh tay roboot sẽ hút chính xác và nạp mẫu vào vòng mẫu bằng 1 xi lanh ở áp suất cao, sau nhờ hệ thống chuyển van mà mẫu đƣợc dòng pha động nạp vào cột tách.
Để phù hợp cấu hình máy và đạt đƣợc yêu cầu về độ chính xác, độ lặp lại của thiết bị, chúng tôi chọn thể tích bơm mẫu là 20 µl vì khi đó sai số nằm trong giới hạn kiểm soát (theo nhà sản xuất ), không ảnh hƣởng đến thành phần dung môi pha động. Lƣợng cơ
52
chất thực vật và HCBVTV trong mẫu vẫn nằm trong giới hạn cho phép đối với khả năng phân giải của cột tách (theo phƣơng pháp tách chiết ).
Toàn bộ các mẫu trên khay đƣợc ổn nhiệt tại 100
C và thời gian bảo quản mẫu < 24h.
Chọn cột tách
Cột tách góp một phần khá quan trọng trong việc quyết định quá trình tách có độ phân giải tốt hay không. Để chọn loại cột có pha tĩnh phù hợp cần căn cứ vào cấu trúc phân tử và độ phân cực của chất phân tích. Với đối tƣợng cần tách là 7 HCBVTV đều có tính chất tan tốt trong nƣớc, pha động phân cực nên cột tách sử dụng phải là cột pha đảo. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng cột Agilent ZorbaxSB C18 với các thông số cột nhƣ sau:
ZorbaxSB C18 (150mm × 4.6mm × 5µm) hoặc tƣơng đƣơng Nhiệt độ cột: 400C
Khảo sát thành phần pha động và chế độ chạy
Pha động và pha tĩnh là hai yếu tố trực tiếp ảnh hƣởng tới điều kiện tách sắc ký. Việc lựa chọn pha động rất quan trọng vì pha động có thể ảnh hƣởng tới độ chọn