2.3.5.1. Tính chọn lọc, đặc hiệu
Tính đặc hiệu: là khả năng phát hiện đƣợc chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác nhƣ các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tƣơng tự, tạp chất… Cụ thể, trong phép phân tích định tính đó là phải chứng minh đƣợc kết quả là dƣơng tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả phải là âm tính khi có mặt các cấu trúc khác gần giống chất phân tích. Trong phép phân tích định lƣợng là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hƣởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hƣớng đến kết quả chính xác. Tính đặc hiệu thƣờng liên quan đến việc xác định chỉ một chất phân tích.
Tính chọn lọc: Là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung một qui trình. Nếu chất cần xác định phân biệt rõ với chất khác thì phƣơng pháp phân tích có tính chọn lọc. Nhƣ vậy, tính chọn lọc có thể bao trùm cả tính đặc hiệu. Do các phƣơng pháp phân tích thƣờng có nhiều chất cùng xuất hiện nên khái niệm tính chọn lọc thƣờng mang tính khai quát hơn.
*Cách xác định:
Có nhiều cách xác định tính đặc hiệu, tính chọn lọc, trong nghiên cứu này do thiết bị sắc ký có gắn detecter MS nên chúng tôi so sánh phổ của chất phân tích trên 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn. Mẫu trắng không đƣợc lên tín hiệu chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lƣu tƣơng ứng thời gian lƣu trên mẫu chuẩn.
2.3.5.2. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng
Giới hạn phát hiện LOD: là nồng độ mà tại đó giá trị xác định đƣợc lớn hơn độ không đảm bảo đo của phƣơng pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện đƣợc nhƣng chƣa thể định lƣợng đƣợc.
Có nhiều các xác định LOD: dựa trên độ lệch chuẩn, dựa trên đƣờng chuẩn, dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu. Trong nghiên cứu này chúng tôi xác định LOD dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu đƣờng (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio).
trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích N là nhiễu đƣờng nền
48
LOD đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3).
Giới hạn định lượng LOQ: là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lƣợng bằng phƣơng pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn.
Có nhiều cách xác định LOQ trong nghiên cứu này chúng tôi cũng xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu S/N. LOQ đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10).
2.3.5.3. Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn
Khoảng tuyến tính của một phương pháp: là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đƣợc đo và nồng độ các chất phân tích.
Đường chuẩn: là đƣờng biểu diễn sự phụ thộc tuyến tính giữa đại lƣợng đƣợc đo và nồng độ các chất phân tích.
Để xác định khoảng tuyến tính chúng tôi thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi từ và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Sau đó vẽ đƣờng cong phụ thuộc giữa diện tích pic thu đƣợc vào nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính
Sau khi xác định đƣợc khoảng tuyến tính của các chất, chúng tôi đã xây dựng đƣờng chuẩn trên nền mẫu thực có sử dụng nội chuẩn, nhằm mục đích loại trừ ảnh hƣởng của nền mẫu đến kết quả phân tích. Nội chuẩn đƣợc thêm vào dung dịch chuẩn để đo máy, với nồng độ phù hợp và giống nhau. Vẽ đƣờng cong phụ thuộc giữa tỷ lệ tín hiệu chất ngoại chuẩn và chia cho nội chuẩn (trục tung y) phụ thuộc vào nồng độ ngoại chuẩn (trục hoành x).
2.3.5.4. Độ lặp lại (độ chụm) và độ thu hồi (độ đúng).
Hiện nay có nhiều cách khác nhau về thuật ngữ độ chính xác. Theo quan điểm mới nhất của tiêu chuẩn quốc tế (ISO 5725 1- 6:1994) và tiêu chuẩn quốc gia (TCVN 6910 1-6:2005) thì thuật ngữ độ đúng và độ chụm diễn tả độ chính xác của phƣơng pháp phân tích.
Độ chụm hay độ lặp lại là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại. Độ chụm là một khái niệm định tính và đƣợc biểu diễn định lƣợng bằng độ lệch chuẩn S hay hệ số biến thiên CV (%):
49 1 1 2 N x x S N i i (2-1) CV (%) = .100 x S (2-2) Trong đó: xi : Nồng độ tính đƣợc của lần thử nghiệm thứ i
x : Nồng độ trung bình tính đƣợc của N lần thử nghiệm. N : Số lần thử nghiệm.
Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực hoặc giá trị đƣợc chấp nhận. Độ đúng là khái niệm định tính và đƣợc biểu diễn định lƣợng dƣới dạng độ chệch (Bias) hoặc hiệu suất thu hồi (recovery)
R(%) = C
Cc .100 (2-3) Trong đó:
R: độ thu hồi (%)
C : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn (ng/ml). Cc : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ng/ml).
Để xác định độ chụm và độ đúng của phƣơng pháp phân tích, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nhƣ sau: Tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau (mỗi mức làm lặp lại 10 lần) và tính toán kết quả theo công thức trên.
50
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định hiệu lực sinh học của thuốc đối với cây trồng
3.1.1. Tỉ lệ bệnh, mật độ côn trùng trƣớc và sau khi xử lý thuốc
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thuốc đối với côn trùng, bệnh gây hại đến cây trồng (hình 3.1,3.2 và các hình 3.10-3.14 ,bảng số liệu phụ lục 1).
Hình 3.1. Mật độ bọ phấn (Bemisia tabaci) trên cà chua trong thời gian khảo nghiệm
Hình 3.2 . Tỉ lệ % bệnh thối nhũn (Erwinnia caratovora) trên bắp cải trong thời gian khảo nghiệm
51
* Ảnh hưởng của thuốc đối với cây trồng ở các ngày sau xử lý thuốc
Cây trồng Cấp hại 1NSXL 3NSXL 7NSXL Cà chua 1 1 1 Bắp cải 1 1 1 Chè 1 1 1 Thanh long 1 1 1 Dƣa chuột 1 1 1 Nhãn 1 1 1 Dƣa hấu 1 1 1
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của thuốc đối với cây trồng ở các ngày sau xử lý thuốc Kết quả thống kê bảng 3.1,3.10 – 3.18 và hình 3.2,3.3 và các hình 3.10 – 3.14 cho thấy:
- Tất cả các thuốc đều có hiệu lực ngay sau khi phun thuốc. Cụ thể nhƣ, mật độ côn trùng giảm rõ rệt ngay sau phun 1 ngày, tỉ lệ bệnh trên cây không còn tăng so với tỉ lệ bệnh ở ô đối chứng.
- Không có biểu hiện ngộ độc cây rau ở tất cả các ô công thức thí nghiệm
3.2. Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp phân tích dƣ lƣợng 7 HCBVTV
3.2.1. Tối ƣu hoá các điều kiện đo trên thiết bị HPLC – MS/MS 3.2.1.1. Khảo sát các điều kiện hệ thống HPLC 3.2.1.1. Khảo sát các điều kiện hệ thống HPLC
Chọn điều kiện bơm mẫu
Với hệ thống HPLC – MS/MS 6410MS (Agilent), bộ phận bơm mẫu là tự động (Auto Sampler). Mẫu đã chuẩn bị nạp vào ống 2ml đặt trong khay, sau đó cánh tay roboot sẽ hút chính xác và nạp mẫu vào vòng mẫu bằng 1 xi lanh ở áp suất cao, sau nhờ hệ thống chuyển van mà mẫu đƣợc dòng pha động nạp vào cột tách.
Để phù hợp cấu hình máy và đạt đƣợc yêu cầu về độ chính xác, độ lặp lại của thiết bị, chúng tôi chọn thể tích bơm mẫu là 20 µl vì khi đó sai số nằm trong giới hạn kiểm soát (theo nhà sản xuất ), không ảnh hƣởng đến thành phần dung môi pha động. Lƣợng cơ
52
chất thực vật và HCBVTV trong mẫu vẫn nằm trong giới hạn cho phép đối với khả năng phân giải của cột tách (theo phƣơng pháp tách chiết ).
Toàn bộ các mẫu trên khay đƣợc ổn nhiệt tại 100
C và thời gian bảo quản mẫu < 24h.
Chọn cột tách
Cột tách góp một phần khá quan trọng trong việc quyết định quá trình tách có độ phân giải tốt hay không. Để chọn loại cột có pha tĩnh phù hợp cần căn cứ vào cấu trúc phân tử và độ phân cực của chất phân tích. Với đối tƣợng cần tách là 7 HCBVTV đều có tính chất tan tốt trong nƣớc, pha động phân cực nên cột tách sử dụng phải là cột pha đảo. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng cột Agilent ZorbaxSB C18 với các thông số cột nhƣ sau:
ZorbaxSB C18 (150mm × 4.6mm × 5µm) hoặc tƣơng đƣơng Nhiệt độ cột: 400C
Khảo sát thành phần pha động và chế độ chạy
Pha động và pha tĩnh là hai yếu tố trực tiếp ảnh hƣởng tới điều kiện tách sắc ký. Việc lựa chọn pha động rất quan trọng vì pha động có thể ảnh hƣởng tới độ chọn lọc của hệ pha, thời gian lƣu trữ, hiệu quả tách của cột, độ rộng của pic sắc ký ...Vì các HCBVTV trong nghiên cứu tan tốt trong nƣớc và căn cứ giá thành đề tài đã chọn hệ dung môi là nƣớc và acetonitril [25].
Khảo sát tốc độ dòng pha động
Tốc độ dòng pha động liên quan đến quá trình thiết lập cân bằng của chất tan trong hai pha tĩnh và pha động. Khi tốc độ pha động nhỏ, chất phân tích ra muộn, gây doãng chân pic, giảm độ nhạy và tốn dung môi. Ngƣợc lại, khi tốc độ pha động quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp mẫu chƣa kịp tách ra khỏi nhau, dẫn đến hiện tƣợng chồng pic và gây áp suất lớn trong bơm [15].
Trong chế độ chạy trộn dung môi, khi cố định chế độ đo phần MS/MS bằng cách tăng dần tỷ lệ ACN và thay đổi tốc độ pha động ở các mức:0,5; 0,6; 0,7 ; 0,8 ; 0,9 và 1 ml/phút căn cứ độ hẹp pic, độ cân xứng của pic để lựa chọn. Thực nghiệm cho thấy tại tỷ lệ thể tích của hai kênh A và kênh B là 65% : 35%, tốc độ dòng là 0,6 ml/phút píc thu đƣợc nhọn, hẹp và cân đối.
53
Hình 3.3: Sắc ký TIC 7 HCBVTV
Chúng tôi nhận thấy tốc độ dòng thực nghiệm (0,6 ml/phút) nhỏ hơn so mức khuyến cáo của nhà sản suất (1 ml/phút). Nhƣng điều này là phù hợp với hệ thống HPLC-MS/MS vì tốc độ dòng thấp sẽ thuận lợi cho quá trình hóa hơi dung môi, tách và ion hóa hoạt chất phân tích của nguồn ion hóa ESI.
Bảng 3.2. Tóm tắt điều kiện tốc độ dòng pha động để tách hỗn hợp HCBVTV
Thời gian (phút) Tốc độ dòng (mL/phút) Kênh A Kênh B 0,01 0,6 65 35 1,00 0,6 65 35 7,00 0,6 100 0 10,00 0,6 100 0 10,10 0,6 65 35 12,00 0,6 65 35
3.2.1.2. Khảo sát các điều kiện khối phổ MS/MS
Để phân tích HCBVTV bằng sắc ký lỏng khối phổ MS/MS cần phải xác định đƣợc ion phân tử (ion mẹ) và ion sản phẩm (ion con) của HCBVTV. Với nguồn ion hóa ESI, chế độ ion dƣơng các ion phân tử thƣờng đƣợc tạo thành bằng cách thêm một proton vào khối lƣợng phân tử của chất đó. Dựa vào khối lƣợng phân tử của các HCBVTV, trên cơ sở tham khảo các nghiên cứu trƣớc đây trên thế giới, chúng tôi đã xác định đƣợc các ion phân tử của từng HCBVTV (bảng 2.4).
Tuy nhiên, để định tính và định lƣợng cần phải xác định đƣợc ion sản phẩm của từng HCBVTV. Sử dụng kim tiêm mẫu 20 µl tiêm trực tiếp các chất chuẩn HCBVTV có nồng độ 160 ng/ml vào MS để xác định hai ion con ứng với từng chất. Ion con có
54
tín hiệu lớn hơn đƣợc sử dụng để làm ion định lƣợng, ion con có tín hiệu thấp hơn đƣợc dùng cho mục đích xác nhận (khẳng định). Các thông số bắn phá nhƣ Dwell time (Chu kỳ quét), Fragmentor (Điện áp phân mảnh), và CE (năng lƣợng va chạm) đƣợc tối ƣu tự động theo thiết bị MS. Các kết quả đƣợc tổng hợp ở bảng 2.4.
Bảng 3. 3: Điều kiện tối ƣu cho thiết bị HPLC – MS/MS
HPLC MS/MS
Tỷ lệ kênh A : B = 60% : 35% Chế độ ion hóa : ESI-posetive Tốc độ dòng : 0,6 ml/phút Chu kỳ quét : theo bảng 2.3
Áp suất đầu phun :4000V Điện thế phân mảnh : theo bảng 2.3 Năng lƣợng va chạm : theo bảng 2.3
3.2.2. Nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp 3.2.2.1.Tính chọn lọc, đặc hiệu của phƣơng pháp 3.2.2.1.Tính chọn lọc, đặc hiệu của phƣơng pháp
Tính chọn lọc, đặc hiệu của phƣơng pháp phân tích đa dƣ lƣợng thể hiện khả năng phân biệt một chất với các chất còn lại và với nền mẫu. Để đánh giá tính chọn lọc, đặc hiệu chúng tôi phân tích các mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn. Hình 3.4 và 3.5 giới thiệu sắc đồ của hỗn hợp chuẩn trên mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn.
Mẫu trắng là mẫu không chứa các HCBVTV trong nghiên cứu, đƣợc thực hiện theo quy trình chiết mẫu (Hình 2.1).
Mẫu thêm chuẩn là mẫu trắng đƣợc bổ sung thêm một lƣợng chất chuẩn cần phân tích đã biết trƣớc nồng độ. Mẫu thêm chuẩn đƣợc chuẩn bị và phân tích nhƣ đối với các mẫu thực để xem xét quá trình thực hiện của một phƣơng pháp phân tích.
55
Hình 3.4. Sắc đồ TIC ở mẫu trắng
Hình 3.5. Sắc đồ pic TIC ở mẫu thêm chuẩn
Nhận xét: Thời gian lƣu của các HCBVTV trên nền mẫu thêm chuẩn hoàn toàn giống với trên mẫu chuẩn (hình 3.1), không xuất hiện pic ở mẫu trắng ở cả hai ion con..
Mặt khác, với mỗi chất ta có hai ion con dùng để định lƣợng và khẳng định do đó sự có mặt của HCBVTV đƣợc chắc chắn. Điều này đáp ứng đƣợc yêu cầu của các tổ chức trên thế giới nhƣ AOAC, Châu Âu [21,22, 37, 38].
3.2.2.2. Khảo sát xây dựng đƣờng chuẩn
Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc của diện tích pic sắc ký vào nồng độ của các chất chuẩn để tìm giới hạn tuyến tính và lập đƣờng chuẩn. Từ dung dịch chuẩn gốc (stock) pha các dãy dung dịch chuẩn sau :
- Dãy dung dịch chuẩn trung gian : 100; 10; 1; 0,1 µg/ml
- Dãy dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ là : 10; 20; 40; 80; 160 ng/ml
Trong đó các dung dịch chuẩn trung gian pha trong ACN. Dung dịch chuẩn làm việc định mức bằng hỗn hợp ACN.
56
Tiến hành bơm vào hệ thống HPLC-MS/MS theo các điều kiện đã tối ƣu ở trên. Tại mỗi nồng độ lặp lại 2 lần (riêng tại nồng độ 10 ng/ml thì lặp lại nhiều hơn)
Kết quả khảo sát các thông số biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ của Fluoxastrobin và diện tích pic tƣơng ứng đƣợc thể hiện trong bảng 3.4:
Bảng 3.4: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ chuẩn Fluoxastrobin
Tên Kiểu mẫu
Các mức nồng độ (ng/ml) Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (pA*Hz) Nồng độ tính theo đường chuẩn (ng/ml) Độ chính xác (%) ACN DM ACN DM ACN DM Fluoxastrobin 10 ng/ml Chuẩn L5 7,283 3310,37 8,772 97,104 Fluoxastrobin 10 ng/ml Chuẩn L5 7,276 3336,47 9,116 97,122 Fluoxastrobin 10 ng/ml Chuẩn L5 7,219 3368,88 10,001 99,884 Fluoxastrobin 10 ng/ml Chuẩn L5 7,267 3436,54 10,118 100,147 Fluoxastrobin 10 ng/ml Chuẩn L5 7,209 3411,81 10,115 102,154 Fluoxastrobin 10 ng/ml Chuẩn L5 7,258 3322,16 9,993 100,115 Fluoxastrobin 20 ng/ml Chuẩn L4 7,274 6546,96 21,848 107,989 Fluoxastrobin 20 ng/ml Chuẩn L4 7,236 6584,15 21,224 105,155 Fluoxastrobin 40 ng/ml Chuẩn L3 7,247 13245,51 41,887 107,695 Fluoxastrobin 40 ng/ml Chuẩn L3 7,258 13336,48 41,554 105,360 Fluoxastrobin 80 ng/ml Chuẩn L2 7,231 25655,15 81,878 97,873 Fluoxastrobin 80 ng/ml Chuẩn L2 7,218 25991,51 82,635 101,740 Fluoxastrobin 160 ng/ml Chuẩn L1 7,278 50874,79 159,935 97,475 Fluoxastrobin 160 ng/ml Chuẩn L1 7,291 51224,32 159,114 95,590
57
Từ kết quả thu đƣợc ở bảng3.7, chúng tôi xác định các giá trị: giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn đinh lƣợng (LOQ), giới hạn tuyến tính của đƣờng chuẩn (LOL) để từ đó xác định khoảng tuyến tính của đƣờng chuẩn .
Trong thiết bị phân tích, phần mềm Agilent-Mass Hunter B1.0 giúp lập đƣờng chuẩn bậc nhất dạng hồi quy khối để từ đó xác định đƣợc giá trị LOD, LOQ và LOL.
Hình 3.6: Đƣờng chuẩn của Fluoxastrobin trong khoảng tuyến tính Bảng 3.5: Các thông số đƣờng chuẩn đối với các HCBVTV (Curve fit)
Name Weight R2 Standard Error Equation Sulfoxaflor 1/x 0,999394 0,6 y= 17,4738x+342654 Isotianil 1/x 0,974679 28,1 y = 22,6282x+1733,1911 Indaziflam 1/x 0,994084 7,1 y = 62,4035x+23,1915 Fluoxastrobin 1/x 0,998200 31,8 y = 318,0592x+214,0728