Tác dụng diệt khuẩn của hydroperoxide là do khả năng oxy hóa mạnh của nó trên tế bào vi khuẩn. Các lipid màng và các nhóm protein có thể bị oxy hóa. Hơn nữa, một số phản ứng hydroperoxide tạo ra oxy nguyên tử do đó tạo ra một môi trường yếm khí, không thích hợp cho một số loài vi sinh vật. Sự hình thành hydroperoxide: trong điều kiện có oxy, vi khuẩn axit lactic có thể tổng hợp hydroperoxide (H2O2). Trong trường hợp không có nguồn heme, vi khuẩn axit lactic không tạo ra catalase để loại bỏ hydroperoxide. Các hệ thống khác loại bỏ hydroperoxide kém hoạt động hơn các hệ thống tạo ra hợp chất hữu cơ này, dẫn đến tích tụ hydroperoxide [32].
Sản xuất H2O2 được sử dụng để ngăn ngừa sự phát triển của mầm bệnh thực phẩm và cũng có lợi trong bảo quản thực phẩm [37]. Vi khuẩn lactic có khả năng sinh H2O2 đã được chứng minh là ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh ở nhiệt độ lạnh. Hydrogen peroxide có thể can thiệp vào các đặc tính cảm quan của sản phẩm thịt lên men bằng cách giảm độ ôi và đổi màu của sản phẩm cuối cùng. H2O2 Có thể được sinh ra từ một số chủng LAB liên quan đến quá trình lên men thịt như
Lactobacillus sakei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pentosus and
Pediococcus acidilactici, có hoạt tính catalase phụ thuộc vào heme đang hoạt động
trong các sản phẩm thịt vì các chất này có chứa heamin (Abriouel et al., 2004).
Hydrogen peroxide được biết là chất kháng khuẩn tùy thuộc vào nồng độ được cung cấp và các yếu tố môi trường chẳng hạn như pH và nhiệt độ. Nhiệt độ là một thông số cực kỳ quan trọng để xác định hiệu quả của hydro peroxide đối với bào tử. Ở nhiệt độ phòng ảnh hưởng của H2O2 là yếu nhưng rất mạnh ở nhiệt độ cao [23].
PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 1/2020 – 6/2020.
- Địa điểm nghiên cứu: Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
- Chitosan dạng bột do Việt Nam sản xuất có độ đề axetil hóa DA > 85%, trọng lượng phân tử khoảng 300.000 DA. Được cung cấp bởi công ty MTD chi nhánh Bình Dương.
- Acid citric- Việt Nam
- Chế phẩm hydroperoxide nano bạc- Mỹ
- Đậu phụ được làm từ đậu tương ĐT 84 có chất lượng tốt, không hư hỏng không nấm mốc, hạt đậu tương có màu vàng sáng, có kích thước đồng đều, chất tạo đông đậu phụ được sử dụng là dịch sữa đậu lên men lactic. Đậu phụ có màu trắng ngà, có mùi thơm đặc trưng của đậu nành nấu chín, lớp vỏ nhẵn, không có vết nứt vỡ, vết cắt mịn, ăn mềm, lấy tay ấn nhẹ, có sự đàn hồi, sở tay hơi ráp, cầm không gẫy, vỡ. được sản xuất tại bộ môn Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
3.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến chất lượng và thời gian bảo quản đậu phụ
Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ acetic acid đến chất lượng và thời gian bảo quản đậu phụ
Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến chất lượng và thời gian bảo quản đậu phụ
Nội dung 4: Nghiên cứu so sánh hiệu quả bảo quản của các chất bảo quản khác nhau đến chất lượng và thời gian bảo quản đậu phụ
3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến chất lượng và thời gian bảo quản đậu phụ bảo quản đậu phụ
Thí nghiệm gồm 5 công thức nhắc lại 2 lần ĐC: không xử lý chitosan CT1: Chitosan nồng độ 0,75% CT2: Chitosan nồng độ 1 % CT 3: Chitosan nồng độ 1,25% CT4: chitosan nồng độ 1,5% Các chỉ tiêu phân tích - Xác định chỉ số pH bằng máy đo pH
- Xác định protein tổng số bằng phương pháp kjeldah
- Phương pháp xác định vi sinh vật hiếu khí tổng số theo TCVN 5165-90 - Phương pháp xác định nấm men, nấm mốc
- Phương pháp xác định Ecoli (coliforms chịu nhiệt) phương pháp MPN theo TCVN 6846: 2007
- Chất lượng cảm quan được đánh giá theo TCVN 321579
3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ citric acid đến chất lượng và thời gian bảo quản đậu phụ quản đậu phụ
Thí nghiệm gồm 5 công thức 2 lần nhắc lại ĐC: không xử lý acid citric
CT1: citric acid nồng độ 0,75% CT2: citric acid nồng độ 1 % CT 3: citric acid nồng độ 1,25% CT4: citric acid nồng độ 1,5% Các chỉ tiêu phân tích - Xác định chỉ số pH bằng máy đo pH
- Xác định protein tổng số bằng phương pháp kjeldah
- Phương pháp xác định nấm men, nấm mốc
- Phương pháp xác định Ecoli (coliforms chịu nhiệt) phương pháp MPN theo TCVN 6846: 2007
- Chất lượng cảm quan được đánh giá theo TCVN 321579
3.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của H2O2 đến chất lượng và thời gian bảo quản đậu phụ đậu phụ
Thí nghiệm gồm 5 công thức 2 lần nhắc lại ĐC: không xử lý H2O2 CT1: H2O2 nồng độ 20 ppm CT2: H2O2 nồng độ 30 ppm CT 3: H2O2 nồng độ 40 ppm CT4: H2O2 nồng độ 50 ppm Các chỉ tiêu phân tích - Xác định chỉ số pH bằng máy đo pH
- Xác định protein tổng số bằng phương pháp kjeldah
- Phương pháp xác định vi sinh vật hiếu khí tổng số theo TCVN 5165-90 - Phương pháp xác định nấm men, nấm mốc
- Phương pháp xác định Ecoli (coliforms chịu nhiệt) phương pháp MPN theo TCVN 6846: 2007
- Chất lượng cảm quan được đánh giá theo TCVN 3215-79
3.3.4. Nghiên cứu so sánh hiệu quả bảo quản của các chất bảo quản khác nhau đến chất lượng và thời gian bảo quản đậu phụ đến chất lượng và thời gian bảo quản đậu phụ
Thí nghiệm gồm 4 công thức và nhắc lại 2 lần ĐC: không xử lý chất bảo quản
CT1: là nồng độ tốt nhất ở TN1 CT2: là nồng độ tốt nhất ở TN2 CT3: là nồng độ tốt nhất ở TN3
Các chỉ tiêu phân tích
- Xác định protein tổng số bằng phương pháp kjeldah
- Xác định acid hữu cơ tổng số bằng phương pháp chuẩn độ NaOH - Phương pháp xác định vi sinh vật hiếu khí tổng số theo TCVN 5165-90 - Phương pháp xác định nấm men, nấm mốc
- Phương pháp xác định Ecoli (coliforms chịu nhiệt) phương pháp MPN theo TCVN 6846: 2007
- Chất lượng cảm quan được đánh giá theo TCVN 3215-79
3.4. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp xác định pH
Xử lý mẫu: đậu phụ được nghiền nhỏ bằng cối chày sứ. Cách tiến hành:
Nghiền 5g đậu phụ trong 25 ml nước khử ion và được trộn đều bằng voltex (IKA Voltex Genius 3, German). Sau đó dịch đậu phụ được lọc bằng giấy lọc và đem đi đo pH bằng máy đo pH (Hanna HI 2210 pH meter, German).
3.4.2. Định lượng protein trong đậu phụ bằng phương pháp Kjeldahl
Cân 1 gram mẫu cho vào ống nghiệm công phá Kjeldahl 250ml trong ống, thêm hốn hợp chất xúc tác theo tỷ lệ K2SO4/CuSO4 ( 3:1) cho tiếp 10ml H2SO4 98%. Sau đó, mang mẫu đặt vào thiết bị công phá mẫu. Mấu công phá xảy ra theo 3 giai đoạn: giai đoạn 1: 30 phút ở nhiệt độ 2500C; giai đoạn 2: 30 phút ở nhiệt độ 3000C; giai đoạn 3: 60 phút ở nhiệt độ 4200 C; đến khi dung dịch trong ống đốt chuyển sang màu xanh. Lúc này mẫu chuyển từ dạng nitơ hữu cơ sang dạng vô cơ (NH4)2SO4. Để nguội trong vòng 10 phút rồi tiến hành chuyển sang máy chưng cất UDK 142. Ở đây, sử dụng NaOH để đẩy NH3 ra khỏi muối Amoni, NH3 sau khi được giải phóng ra sẽ được cuốn đi bằng dòng hơi nước nóng. Sau khi được làm nguội sẽ được hấp thụ vào dung dịch H3BO3 ở trong bình hứng tạo ra muối borat amon có màu xanh lá trong. Thời gian chạy một mẫu phân tích là 6 phút. Để xác định được lượng NH3 giải phóng ra trong quá trình chưng cất ta đem đi chuẩn độ bằng axit H2SO4 0,1N đến khi nào dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt. Từ lượng axit H2SO4 0,1N tiêu tốn trong quá
trình chuẩn độ chúng tôi tính được lượng protein có trong mẫu. Công thức tính như sau:
𝑁% =( 𝑉2− 𝑉1) × 1,42 × 100 × f w
Trong đó:
N: Hàm lượng Protein có trong mẫu(%)
V1: Thể tích NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ cho mẫu phân tích(ml) V2: Thể tích H2SO4 0,1N(ml) cho vào bình hứng
f: Hệ số chuẩn độ axit(hệ số sử dụng dung dịch) w: Khối lượng mẫu(gram)
1,42: Lượng Nitơ tương ứng với 1ml dung dịch H2SO4 0,1N
Chúng ta biết rằng trong đạm chứa khoảng 16% N, vì vậy việc tính toán lượng đạm từ hàm lượng N thường được dùng hệ số 100/16 = 6,25. Hệ số này thường được dùng trong quá trình phân tích thức ăn.
3.4.3. Phương pháp định lượng axit hữu cơ tổng số
Nghiền nhỏ 2 gam mẫu trong cối sứ, sau đó chuyển sang bình tam giác 250ml, thêm nước đến thể tích 150 ml. Đun 30 phút cách thuỷ bằng bể ổn nhiệt 80 – 900C, thỉnh thoảng lắc. Khi dung dịch nguội, lọc vào bình định mức 250, lên thể tích tới vạch bằng nước cất.
Lấy 50 ml dịch lọc cho vào bình tam giác, cho thêm vào 1 – 2 giọt phenolphetalein rồi chuẩn độ bằng NaOH cho đến khi xuất hiện màu hồng
Hàm lượng axit tính theo công thức
c v T V a X . 100 . . . 0067 , 0 . Trong đó: X: Hàm lượng acid (%) a: Số ml NaOH 0,1N cần để chuẩn độ
T: Hệ số hiệu chỉnh đối với NaOH 0,1N V: Tổng thể tích dung dịch chiết
v: Số ml dung dịch lấy để chuẩn độ c: Khối lượng mẫu(gam)
3.4.4. Phương pháp xác định vi sinh vật tổng số
Nguyên tắc: Nuôi cấy một lượng mẫu nhất định hoặc mẫu đã pha loãng trên môi trường thạch dinh dưỡng ở nhiệt độ 30 ± 10 C trong điều kiện yếm khí trong khoảng thời gian từ 48 – 72h sau đó đếm số khuẩn lạc mọc trên đó từ đó có thể đếm được số tế bào sống có trong mẫu phân tích (chú ý chọn độ pha loãng thích hợp sao cho số khuẩn lạc trên mỗi đĩa petri trong khoảng 30 – 300).
Phương pháp tiến hành
- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy : môi trường xác định vi sinh vật tổng số là môi trường TGA(Tripton – Glucose – Agar)
Môi trường nuôi cấy(TGA: Tripton – Glucose – Agar)
STT Thành phần Khối lượng 1 Pepton 5 g 2 Glucose 4 g 3 Cao nấm men 2,5g 4 Agar 15g 5 Nước cất 1 lít Khử trùng 20 phút nhiệt độ 1210C
- Pha loãng mẫu: nghiền nhỏ đậu phụ bằng cối chày sứ, trộn đều, cân 1 gam mẫu, pha loãng tới nồng độ 10-2, 10-3(thao tác không quá 30 phút)
- Cấy mẫu: lấy 100μl mẫu đã pha loãng cấy trên đĩa petri có môi trường TGA, mỗi nồng độ pha loãng cấy 3 đĩa, sau đó nuôi trong tủ ấm ở 370C sau 48 đến 72 giờ, đếm tất cả khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa thạch(số lượng khuẩn lạc trong mỗi đĩa từ 30 -300 khuẩn lạc). Số lượng vi sinh vật trung bình trong 1g mẫu được tính theo công thức.
N khuẩn lạc/g hay ml = V f n n C 1 2 1 ) (
Trong đó ∑C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa n1:số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ nhất
n2: số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2 f1. Hệ số pha loãng ở đĩa đếm thứ nhất V thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa petri
Chú ý: Nếu ngay ở đĩa cấy mẫu nguyên chất(lỏng) hoặc dung dịch huyền phù gốc mà có số lượng khuẩn lạc ít hơn 30 khuẩn lạc thì vẫn lấy kết quả đó.
3.4.5. Phương pháp xác định Nấm men – Nấm mốc
Nguyên tắc: môi trường nuôi cấy chứa chất ức chế vi khuẩn(chất kháng sinh như Oxytetracylin hoặc Chloramphenicol) nuôi ở 30 ± 10C trong điều kiện hiếu khí sau 48 – 72h. Đếm số khuẩn lạc trên đĩa petri từ đó xác định được tổng số nấm men – nấm mốc
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:
Môi trường nuôi cấy(YGC: Yeast – Clucose – Chloramphenicol)
STT Thành phần Khối lượng 1 Glucose 20 g 2 Cao nấm men 5 g 3 Chloramphenicol 0,1g 4 Agar 20g 5 Nước cất 1 lít Khử trùng 20 phút nhiệt độ 1210C
Phương pháp chuẩn bị và pha loãng mẫu, và tiến hành xác định số lượng tế bào như đối với thí nghiệm xác định vi sinh vật tổng số.
3.4.6. Phương pháp xác định E.coli (coliforms chịu nhiệt) phương pháp MPN theo TCVN 6846: 2007 [53]. TCVN 6846: 2007 [53].
Đậu phụ được nghiền nhỏ bằng cối chày sứ, trộn đều cân 1g mẫu, tiến hành pha loãng tới nồng độ 10-2, 10-3 ( thao tác không quá 30 phút).
Cấy 1ml dịch mẫu ở nồng độ pha loãng trên vào 3 ống nghiệm đựng môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép và nồng độ đơn( Phụ lục B). Ủ ấm các ống môi trường nồng độ đơn và nồng độ kép ở 37℃ đến 48 giờ. Sau 24 giờ đến 48 giờ kiểm tra các ống nghiệm về sự sinh khí. Từ mối ống môi trường nông độ kép cho thấy mờ, đục hoặc sinh khí, được cấy truyền vào ống nghiệm đựng môi trường chọn lọc (canh thang EC- phụ lục B). Ủ các ống nghiệm thu được ở 44℃ đến 48 giờ. Sau 24 giờ đến 48 giờ kiểm tra các ống nghiệm về sự sinh khí. Nếu các ống nghiệm thu được cho thấy sinh khí thì cần cấy truyền sang ống nghiệm có chứa nước pepton không chứa indol. Ủ ống nghiệm thu được ở 44℃ đến 48 giờ. Kiểm tra ống nghiệm về sự sinh indol do sự phân hủy của trytophan trong pepton. Các ống nghiệm cho thấy mờ đục, hoặc sinh khí trong môi trường tăng sinh lỏng và khi được cấy truyền có sinh khí trong canh thang EC và sinh indol trong nước pepton ở 44℃ được coi là các ống có chứa E.coli giả định. Xác định số có xác suất lớn nhất của E.coli giả định theo bảng MPN (TCVN 6404(ISO 7218).
3.4.7. Phương pháp đánh giá chất lượng cảm quan [9].
Chất lượng cảm quan được đánh giá theo TCVN 3215-79
Bậc đánh Giá Điểm chưa có trọng số Cơ sở đánh giá 0 5
Trong chỉ tiêu đang xét thì sản phẩm có tiêu chuẩn tốt đặc trưng và rõ rệt cho chỉ tiêu đó, sản phẩm không có sai lỗi hay khuyết tật nào
1 4
Sản phẩm có sai lỗi nhỏ hoặc khuyết tật nhỏ nhưng không làm hỏng giá trị cảm quan của sản phẩm
2 3
Sản phẩm có sai lỗi nhỏ hoặc khuyết tật nhỏ hoặc cả hai làm giảm giá trị cảm quan nhưng sản phẩm vẫn đạt tiêu chuẩn
3 2
Sản phẩm có sai lỗi, khuyết tật hoặc cả hai, số lượng và mức độ sản phẩm không đạt chất lượng quy định trong tiêu chuẩn nhưng sản phẩm vẫn có khả năng bán được.
4 1
Sản phẩm có khuyết tật hoặc sai lỗi ở mức độ trầm trọng, không đạt mục đích sử dụng của sản phẩm đó, không bán được, bị coi là hỏng nhưng sau khi tái chế có khả năng sử dụng được.
5 0
Sản phẩm có khuyết tật hoặc mức độ sai lỗi trầm trọng, sản phẩm được coi là hỏng không còn sử dụng được nữa
Chất lượng cảm quan của đậu phụ được đánh giá dựa trên 4 chỉ tiêu là màu sắc, mùi, vị, trạng thái. Tiêu chuẩn Việt Nam sử dụng thang điểm 20 gồm 6 bậc từ 0 – 5, điểm cao nhất cho một chỉ tiêu là 5 và điểm thấp nhất cho một chỉ tiêu là 0. Khi đánh giá mỗi kiểm nghiệm viên căn cứ vào kết quả ghi nhận đối chiếu với bảng với bảng mô tả và các chỉ tiêu và dùng số nguyên để cho điểm từ 0 - 5. Nếu có nhiều kiểm nghiệm viên cùng đánh giá (N là số lẻ) thì điểm chung bình chung là kết quả trung bình cộng của kiểm nghiệm viên, lấy chính xác 2 chữ số thập phân sau dấu phẩy. Tích của trung bình cộng của một chỉ tiêu với hệ số quan trọng của chỉ tiêu đó là điểm trung bình có trọng lượng của chỉ tiêu đó. Điểm trung là tổng số điểm có trọng lượng của tất cả các