Xử lý dịch pha loãng (Acid hóa)

CHƯƠNG 3 : CHỌN VÀ THUYẾT MINH QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ

3.2 Thuyết minh dây chuyền sản xuất:

3.2.2. Xử lý dịch pha loãng (Acid hóa)

 Mục đích:

Chuẩn bị cho quá trình lên men và tiêu diệt vi sinh vật gây hại. Dùng H2SO4 đậm đặt để loại bỏ Ca2+ chứa nhiều trong rỉ đường, nó ảnh hưởng đến quá trình lên men, đồng thời cũng loại các tạp chất không mong muốn (quá trình acid hóa sẽ làm Ca2+ kết hợp với SO42- tạo thành kết tủa lắng xuống, kéo theo nhiều chất cặn khác có trong rỉ đường) và các vi sinh vật tạp nhiễm. Ngoài ra nó có vai trò thuỷ phân (nhờ ion H+ ) đường saccharose trong mật rỉ thành các đường đơn ( glucose và fructose) là nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật dễ dàng sử dụng.

C12H22O11 + H2O → C6H12O6 (glucose) + C6H12O6 (fructose) Ca2+ + SO42- → CaSO4↓

 Biến đổi:

- Hóa học: đường saccharose chuyển hóa thành đường glucose

- Hóa lý: phá vỡ hệ keo

- Vi sinh: nhiệt độ cao và pH thấp tiêu diệt vi sinh vật  Phương pháp thực hiện:

- Làm loãng mật rỉ đến nồng độ 15- 20% chất khô.

- Acid hóa môi trường bằng H2SO4 đậm đặc với hàm lượng 5% so với khối lượng dung dịch. H2SO4 xem như một chất điều hòa pH, làm phá vỡ hệ keo, chuyển hóa đường saccharose thành đường nghịch đảo giúp quá trình lên men sau này diễn ra tốt hơn.

- Đun dung dịch đến 90 – 95 độ C, trong 6h, sau đó tiến hành ly tâm thu dung dịch trong .

 Thông số kỹ thuật:

- Nồng độ dịch rỉ đường trước khi thủy phân: 50 – 55 Bx

- Nồng độ rỉ đường sau khi thủy phân: 15 – 20 Bx

- Sức chứa: 300L

- Tốc độ cánh khuấy: 120 vòng / phút

- Nhiệt độ thủy phân: 90 – 95 oC

- Thời gian thủy phân: 6h  Thiết bị:

- Thiết bị thủy phân rỉ đường chịu nhiệt và chịu acid

- Thiết bị dẫn truyền dịch rỉ đường vào thiết bị thủy phân

- Thiết bị đo nồng độ đường

Mục đích chuẩn bị cho quá trình lên men, loại bỏ chất kết tủa và các chất cặn lắng nhờ sự khác biệt về khối lượng riêng của dịch trong và tạp chất. Giữ lại chất hòa tan, tách pha rắn khỏi pha lỏng, tăng độ trong của dung dịch và giảm khối lượng riêng dung dịch.  Biến đổi:

- Vật lý: tách các chất bã , tạp chất giữ độ trong và giảm khối lượng riêng cho dung dịch.

- Hóa học: các tạp chất bị loại bỏ, giữ lại các chất hòa tan cần thiết

- Hóa lý: tách pha rắn và pha lỏng riêng biệt  Phương pháp thực hiện:

Sau khi acid hóa trong thời gian lưu khoảng 6h để tinh thể CaSO4 có ḱích thước lớn, dung dịch rỉ đường sẽ được bơm vào thiết bị ly tâm. Hỗn hợp sau ly tâm phân tách thành 2 phần:

- Phần pha lỏng: Dịch trong được đưa vào tank chứa và tiếp tục chuyển qua các bộ phận tiếp theo là pha chế môi trường lên men.

- Phần pha rắn: Gồm bã và CaSO4 đươc cung cấp cho các nhà máy phân bón hoặc sẽ dẫn sang bồn chứa bã để đưa đi xử lí.

 Thông số kỹ thuật:

- Độ trong của dung dịch trước và sau khi ly tâm

- Độ tinh sạch của dịch rỉ đường trước và sau khi ly tâm

- Nồng độ dịch rỉ đường ổn định ở 15 – 20 Bx

- Xác định tỉ trọng ( nhỏ hơn tỉ trọng ban đầu của rỉ đường là 1,4149 g/ml)

- Tốc độ ly tâm 1500 vòng / phút  Thiết bị:

- Vận chuyển bằng bơm thể tích

- Ly tâm bằng máy ly tâm trục vít nằm ngang

- Thiết bị đo độ tinh sạch của dịch rỉ đường

- Tank chứa dịch sau ly tâm

3.2.4. Pha chế dịch lên men:

 Mục đích:

Bổ sung đầy đủ các chất dinh dưỡng, tạo điều kiện môi trường thuận lợi, tối ưu cho vi sinh vật sử dụng và phát triển trong quá trình lên men tạo sinh khối.

 Nhu cầu dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy:

Môi trường dinh dưỡng (dịch lên men) là hỗn hợp các chất dinh dưỡng và các chất này có nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định của pH trong môi trường.

- Vi khuẩn lactic đòi hỏi môi trường nuôi cấy phải có : Glucose + NH4

- Hàng loạt các vitamin ( thiamin, acid nicotinic, biotin, acid folic…)

- Các acid amin

Người ta thường nuôi cấy vi khuẩn lactic trên một môi trường phức tạp chứa một lượng khá cao nấm men, cao thịt và dung dịch rỉ đường.

 Nhu cầu Cacbon:

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các monosaccarit ( glucoza, fructoza, manoza ), các disaccarit ( saccaroza, lactoza, maltoza ) cho đến các polysaccarit ( tinh bột, dextrin ). Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ.

 Nhu cầu Nito:

Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường.Các nguồn ni tơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,…

Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và hiệu quả nhất. tuy nhiên ở quy mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém.

 Nhu cầu vitamin

Đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ rau, củ, quả hay phụ phẩm công nghiệp, dịch tự phân nấm men…

Các loại vitamin mà vi khuẩn lactic thường cần là : riboflavin, thiamin, acid pantothenic, nicotinic, biotin…

 Nhu cầu về muối khoáng các yếu tố vi lượng:

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đày đủ, vi khuẩn lactic rất cần các hợp chất vô cơ như P,S,Mg,Ca,Zn, Fe,Na,Cl. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie đặc biệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào.

Nồng độ tối thích cho vi khuẩn lactic hoạt động là từ 3 – 5%, >6,5% chúng sẽ bị tiêu diệt.

Bảng 3. 1: Thành phần môi trường lên men STT Thành phần Tỷ lệ 1 Rỉ đường 20% 2 FeHPO4 0,2% 3 KH2PO4 0,2% 4 MgSO4 0,1% 5 MnSO4 0,005%

 Yêu cầu kỹ thuật:

- Có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết : Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào.

- Có độ pH thích hợp

- Có độ nhớt nhất định

- Không chứa các yếu tố độc hại

- Tuyệt đối vô trùng  Thiết bị:

- Thiết bị phối trộn môi trường

- Cân định lượng

3.2.5. Tiệt trùng, làm nguội:

 Mục đích:

Tiệt trùng: Tiêu diệt và ức chế hết vi sinh vật và hoạt tính enzyme còn tồn tại trong dung dịch, tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic phát triển, hạn chế tạp nhiễm trong quá trình lên men.

Làm nguội: Hạ nhiệt độ môi trường xuống nhiệt độ thích hợp với vi sinh vật để lên men tạo điều kiện cho giống phát triển.

 Phương thức thực hiện

Sau khi được pha chế, môi trường sẽ qua thiết bị tiệt trùng để ức chế, tiêu diệt vi sinh vật ,enzyme trong môi trường tạo điều kiện tốt cho giống phát triển.

Môi trường dịch lên men được bơm ngược chiều với hơi nước, để tạo ra quá trình trao đổi nhiệt. Trong thực tế, tùy thuộc vào giống vi sinh vật , thành phần hóa học của môi trường, mức độ nhiễm vi sinh vật trong các nguyên liệu pha chế môi trường mà các nhà sản xuất sẽ đề xuất chế độ tiệt trùng thích hợp, với môi trường lên men lactic áp dụng chế độ tiệt trùng là 121oC trong 15 phút. Sau khi tiệt trùng dịch phải được hạ nhiệt độ xuống 50°C, dịch lên men phải vô trùng tuyệt đối.

- Nhiệt độ tiệt trùng: 121 C

- Nhiệt độ làm nguội: 50oC

- Thời gian: 15p

- Giữ nhiệt ở nhiệt độ cao trong vòng 3 – 5s  Thiết bị:

- Hệ thống tiệt trùng bản mỏng

3.2.6. Nhân giống

 Mục đích:

Giống sử dụng là giống vi khuẩn Lactobacillus của nhà máy phân lập và được bảo quản và lưu trữ, để tạo ra đủ số lượng giống cần thiết cho quá trình lên men, số lượng tế bào trong môi trường phải lên giá trị cao nhất, trong thời gian ngắn nhất, với chi phí thấp, đảm bảo giống thuần khiết ( tránh hư hỏng trong quá trình lên men và sản phẩm không đạt yêu cầu).

 Yêu cầu:

- Trong quá trình nhân giống cần đảm bảo cho giống được thuần khiết, điều này rất quan trọng vì nếu giống có lẫn các vi sinh vật lạ thì trong quá trình lên men sẽ gây hư hỏng và làm sản phẩm không đạt yêu cầu và đôi khi còn có hại cho người tiêu thụ.

- Chọn môi trường với thành phần cơ chất thích hợp để nuôi vi sinh vật.

- Chọn phương pháp và các điều kiện nuôi tối ưu (pH, nhiệt độ, sự cung cấp oxi,...) cho quá trình tăng sinh khối của giống.

- Số lượng tế bào trong môi trường nuôi lên giá trị cao nhất, trong khoảng thời gian ngắn nhất, với những chi phí thấp nhất về nguyên liệu và năng lượng.

- Sinh khối thu được phải có hoạt tính lên men cao, tỷ lệ tế bào chết càng thấp càng tốt.

 Tiến hành nhân giống:

*Chuẩn bị giống để lên men:

Ta phải tiến hành các quá trình hoạt hóa giống sau đó nhân giống cấp 1, nhân giống cấp 2, nhân giống sản xuất để chuẩn bị đủ lượng giống dùng trong quá trình lên men

* Nhân giống cấp 1

Với các điều kiện đã khảo sát như pH, nhiệt độ tối ưu cho giống vi khuẩn. Cho 10 % giống vào 50 ml môi trường MRS (môi trường cấp 1) đem ủ ở các điều kiện thích hợp

Bảng 3. 2: Môi trường MRSThành phần Khối lượng (g) Thành phần Khối lượng (g) Pepton 10 Cao thịt 10 Cao nấm men 5 Glucose 20 Tween 80 1 K2HP04 2 Sodium acetate 5 Amonium citrate 2 MgS04.7H20 0,2 MnS04.H20 0,05 Nước cất 1000 ml * Nhân giống cấp 2

Cho 10 % giống từ môi trường cấp 1 vào 50 ml môi trường gồm 5 ml mật rỉ và 45 ml MRS (gọi là môi trường cấp 2). Đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng trong 24 giờ.

* Giống sản xuất :

Cho 10 % giống từ môi trường cấp 2 vào 50 ml môi trường gồm 45 ml mật rỉ và 5 ml MRS (môi trường sản xuất). Đem ủ các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ. Để nuôi cấy sinh khối, cho 10 % giống sản xuất vào môi trường chuẩn bị lên men, tiến hành lên men ở pH, nhiệt độ tối ưu trong thời gian 72 giờ.

SVTH: NGÔ KHA QUÝ GVHD: NGUY N TH MINH XUÂNỄ Ị 40

Giống vsv. Được bảo quản trên thạch

Nhân giống cấp 1 (50ml môi trường

Nhân giống cấp 2 (45ml môi trường

Nhân giống sản xuất ( 45ml rỉ đường + 5ml môi trường)

Hình 3. 2: Sơ đồ tổng quát quá trình nhân giống

 Thông số kỹ thuật:

- Điều kiện vô trùng tuyệt đối

- Nhiệt độ tiệt trùng môi trường: 121oC

- Thời gian tiệc trùng: 15 phút

- Độ pH: 6,3 – 6,5

- Áp suất : 1kg/cm3

- Nuôi cấy ở nhiệt độ: 32 – 35 oC

- Độ ẩm không khí: 90 – 98%

- Thời gian nuôi cấy: 24h

- Số lượng tế bào đạt 106 tế bào/cm3

3.2.7. Lên men

 Mục đích:

Thông qua hoạt động sống của vi sinh vật trong những điều kiện thích hợp để chuyển hóa đường và đạm và tăng sinh khối. Nồng độ dịch lên men là:15–20 %.

 Phương pháp tiến hành:

Vi khuẩn lactic sau khi đảm bảo về số lương (khoảng 106 tế bào/ml) trong quá trình nhân giống sản xuất thì người ta chuyển giống vào thùng lên men với tỉ lệ 10%. Thùng lên men đươc trang bị cánh khuấy và áo nhiệt để cấp nhiệt độ.

Trong sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic người ta thường lên men lactic ở nhiệt độ 370C. Ở nhiệt độ 30 - 350C vi khuẩn Lactobaccillus lên men kém đồng thời các tạp khuẩn sẽ phát triển. Ngươc lại, ở nhiệt độ 40 - 450C hoạt tính vi khuẩn này sẽ giảm sút. Do đó, lên men với vi khuẩn trên người ta thường duy trì ở nhiệt độ ở 370C trong suốt quá trình lên men.

- pH duy trì 6,3 ÷ 6,5 trong suốt quá trình lên men và được kiểm tra 1 giờ/ lần. Thời gian lên men 72 giờ.

- Quá trình lên men lactic sẽ tiến hành thuận lơi khi môi trường có phản ứng acid yếu.

Vi khuẩn lactic sẽ không chịu đươc khi nồng độ acid trong dịch lên men quá lớn. Do đó, nếu lương acid lactic thừa không đươc trung hòa thì sự lên men sẽ bị dừng lại

Trong quá trình lên men người ta sử dụng vôi mịn để trung hòa lương acid tạo thành nhằm tránh hiện tương acid hóa dung dịch lên men và tạo ra canxi lactate. Hằng ngày người ta cho vôi mịn vào 3 ÷ 4 lần trong ngày. Cách trung hòa này vẫn giữ đươc phản ứng acid của môi trường lên men làm cho các vi sinh vật ngoại rơi vào không phát triển đươc. Số lương CaCO3 cho vào với lượng tỷ lệ khoảng 5% mỗi ngày so với tổng lương CaCO3 cần tiêu tốn cho cả quá trình lên men và tạo tủa canxi lactate, tùy thuộc vào lượng acid lactic tạo thành và số lượng CaCO3 cho vào dung dịch lên men đủ để trung hòa acid lactic.

 Những biến đổi trong quá trình lên men:

 Sinh học: Pha thích nghi:

- Vi khuẩn chưa có sự thích nghi nhưng tăng rõ rệt về thể tích và khối lượng tế bào do quá trình tổng hợp chất diễn ra mạnh mẽ.

- Hình thành các enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp cơ chất và các enzyme nằm trong quá trình chuyển hóa cơ chất.

Pha tăng trưởng:

- Sinh khối và khối lượng tế bào tăng rất nhanh.

- Xảy ra hàng loạt các quá trình biến đổi quan trọng để tạo sinh khối: tổng hợp enzyme, chuyển hóa các hợp chất carbonhydrate, các hợp chất nito.

Pha ổn định:

- Quần thể vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào mới sinh ra bằng số tế bào chết đi  sinh khối không tăng.

- Nồng độ cơ chất giảm  tốc độ sinh trưởng giảm.

 Vật lý:

- Sự trao đổi diễn ra liên tục nên có sự tăng nhiệt độ của canh trường nuôi cấy.

- pH thay đổi do xuất hiện các sản phẩm trao đổi chất.

 Hóa lý:

- Các vi khuẩn lactic đồng hình phân giải glucose theo con đường EMP do chúng chứa các enzyme cần thiết (kể cả enzyme aldolaza)

- Các vi khuẩn lactic dị hình do thiếu các enzyme aldolaza và trioxophotphatizomeraza nên giai đoạn đầu của phân giải glucose xảy ra theo con đường PP. Mục đích của quá trình là tổng hợp vật chất tế bào và năng lượng cho vi khuẩn lactic sinh trưởng.

 Các yếu tố cần được kiểm soát trong quá trình lên men:

- pH: pH tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn lactic trong khoảng 6,3 – 6,5 và bị ức chế mạnh tại pH < 4.5

- Oxy: Vi khuẩn lactic là vi khuẩn hiếu khí, hàm lượng Oxy lớn là chất độc đối với chúng

- Độ ẩm: Nước là môi trường cho các phản ứng diễn ra trong tế bào do đó độ ẩm là yếu tố quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic.

- Áp suất thẩm thấu: Màng tế bào chất của vi khuẩn là màng bán thấm. Khi nồng độ muối trong môi trường nuôi cấy cao (<2%) sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn lactic.

 Thông số kỹ thuật:

- Nhiệt độ quá trình lên men: 370C.

- pH trong quá trình lên men duy trì ở 6,3 – 6,5.

- Oxy: Cung cấp oxi bằng cách bơm 0,1–0,4 thể tích hỗn hợp khí cho một đơn vị thể tích dịch trong 1 phút ( v.v-1min-1) bằng máy nén thổi khí vào dịch nuôi cấy.

- Thời gian lên men là : 72 giờ

- Tỷ lệ vi khuẩn bổ sung 10% (v/v)

- Mật số vi khuẩn bổ sung 108 CFU/mL

- Mật độ vi khuẩn sau lên men 1010 CFU/ml