- Cụng thức mỏu, Hct, Hb: Thực hiện tại khoa huyết học Bệnh viện trƣờng Đại học Y Dƣợc Huế bằng mỏy phõn tớch tự động.
- Xột nghiệm chức năng gan: tiếp tục lấy mẫu huyết thanh sản phụ cú HBsAg(+) để định lƣợng men gan SGOT, SGPT tại khoa Sinh húa Bệnh viện trƣờng Đại học Y Dƣợc Huế.
-Xỏc định hoạt tớnh của SGOT trong huyết thanh. - Xỏc định hoạt tớnh của SGPT trong huyết thanh.
2.3.5.1. Xột nghiệm HBsAg
-Tiến hành lấy 3ml mỏu cho vào ống nghiệm, (đối với mẹ), trẻ lấy 1ml mỏu để đụng rồi tỏch huyết thanh ngay, đƣợc bảo đảm trong dõy chuyền lạnh, sau đú lấy huyết thanh để làm xột nghiệm tại Khoa miễn dịch bệnh viện Trƣờng Đại học Y Dƣợc Huế bằng phƣơng phỏp ELISA dựa trờn thử nghiệm Hepanostika HBsAg Uni-Form II của hóng Organon teknika sản xuất.
- Hepanostika HBsAg Uni-Form II là một test ELISA, cơ bản dựa trờn nguyờn lý ―bỏnh mỳ kẹp chả‖ (sandwich) một giai đoạn. khỏng thể đối với HBsAg (anti-HBs) đƣợc ghộp với horsesadish perosidase (HPR) giữ vai trũ nhƣ là một chất kết hợp với tetramethylbenzidine (TMB) và peroxidase nhƣ một chất đệm. Khi hoàn thành thử nghiệm, một màu sắc xuất hiện, gợi ý sự hiện diện của HBsAg, nếu khụng cú màu gỡ hoặc màu nhạt nghĩa là khụng cú sự hiện diện của HBsAg.
- Một cỏch cụ thể, cỏc giếng microelisa đƣợc phủ bởi anti-HBs đƣợc đỏnh dấu bằng HRP.
- Mẫu nghiệm hoặc mẫu chứng thớch hợp chứa HBsAg đƣợc ủ 60 phỳt ở 37°C trong cỏc giếng microelisa. Cỏc hạt liờn kết này tan ra trong mẫu nghiệm và phức hợp khỏng thể (bao gồm khỏng thể / HBsAg / enzyme) đƣợc hỡnh thành. Sau đú đem rửa và ủ với cơ chất TMB ở 18-25°C trong 30 phỳt, cho acide sulfuric vào, phản ứng dừng lại và màu vàng xuất hiện.
+ Nếu khụng cú HBsAg, sẽ khụng cú màu gỡ, hoặc sẽ cú màu vàng rất nhạt. Hàm lƣợng HBsAg trong mẫu tỷ lệ với độ đậm màu xuất hiện.
2.3.5.2. Xột nghiệm HBeAg
- Nguyờn tắc: Dựa trờn kỹ thuật ELISA ―Sandwich‖, cỏc giếng nƣớc đƣợc phủ bởi anti HBe. Khi tiờm huyết thanh thử vào hay cỏc chứng chứa HBeAg sẽ tạo thành phức hợp miễn dịch. Sau khi ủ, mẫu huyết thanh thừa sẽ đƣợc loại bỏ và cỏc giếng đƣợc rửa sạch bằng đệm. Tiếp tục thờm cộng hợp anti HBe gắn peroxidase. Cỏc KT của cộng hợp sẽ gắn vào phức hợp núi trờn (nếu cú). Sau khi rửa sạch và ủ với tetramethylbenzidine, phản ứng hiện màu vàng khi dựng H2SO4 để hóm phản ứng. Nồng độ của chất màu tƣơng ứng với nồng độ của HBe trong huyết thanh. Sự vắng mặt của HBeAg trong huyết thanh biểu hiện bằng sự khụng bắt màu hoặc là rất yếu.
- Tiến hành:
* Gắn cỏc giếng vào khay (stripholder), tốt nhất là sắp xếp đủ thành cỏc strip (8 giếng).
* Nhỏ 100μl mẫu huyết thanh thử và chứng vào cỏc giếng (nhỏ mẫu trƣớc và chứng sau). * Ủ ở 120°C trong 120 phỳt. * Rửa sạch cỏc giếng 4 lần. * Nhỏ 100μl cộng hợp vào cỏc giếng. * Ủ ở 37°C trong 60 phỳt. * Làm ngƣng phản ứng bằng H2SO4 1mol/l.
- Đọc kết quả: Đọc với mỏy đọc ELISA ở bƣớc súng 450nm. Sự dụng mỏy Elecys 2010
Kỹ thuật điện húa phỏt quang theo nguyờn tắc của phản ứng Sandwich + Giỏ trị õm tớnh < 1 à/ml
Độ nhạy: phỏt hiện đƣợc ở nồng độ <0,04 à/ml
2.3.5.3. Xỏc định hoạt tớnh của SGOT trong huyết thanh
+ Nguyờn lý:
L.Aspartate + α Cetoglutarate AST Glutamate + Oxaloacetate Oxaloacetate + NADH + H+ MDH Malate + NAD+
+ Húa chất: (hóng Spinreact) Tõy Ban Nha
Thuốc thử R1 + TRIS PH: 7,8 80mmol/l + LDH (Lactate dehydrogemase)800 v/l
+ MDH (Malate dehydrogemase)600 v/l + L-Aspartate 200mmol/l
Thuốc thử R2 + α Cetoglutarate 12mmol/l + NADH 0,18mmol/l
+ Tiến hành:
- Trộn húa chất theo tỷ lệ 4R1 + 1R2
- Cứ 1ml hỗn hợp thuốc thử trộn với 100àl huyết thanh bệnh nhõn (0,1 ml) ủ trong 1 phỳt. Đọc kết quả.
2.3.5.4. Xỏc định hoạt tớnh của SGPT trong huyết thanh
+ Nguyờn tắc:
L.Alanine + α Cetoglutarate ALT Glutamate + Pyruvate Pyruvate + NADH + H+ MDH Lactat + NAD+
+ Húa chất: (hóng Spinreact) Tõy Ban Nha (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thuốc thử R1 + TRIS PH: 7,8 100mmol/l + LDH (Lactate dehydrogemase)1200 v/l + L-Aspartate 500mmol/l
Thuốc thử R2 + α Cetoglutarate 15mmol/l + NADH 0,18mmol/l
+ Tiến hành:
- Trộn húa chất theo tỷ lệ 4R1 + 1R2
- Cứ 1ml hỗn hợp thuốc thử trộn với 100àl huyết thanh bệnh nhõn (0,1 ml) ủ trong 1 phỳt. Đọc kết quả.