4. Bố cục và nội dung của luận án
2.7. Tiến hành chạy flow cytometry xác định nồng độ tối ưu giữa tương tác kháng
thể (Ab) và hạt nano phát quang (NC).
• Vật liệu:
Các phức hợp đã gắn kháng thể cho từng tác nhân Kháng thể chuẩn của máy
• Phương pháp:
Phương pháp flow cytometry được tiến hành chạy trên máy BD FACSCalibur Calibrate
Các phức hợp gắn với kháng thể, sẽ được tiến hành xác định sự khác biệt giữa hạt QD có gắn kháng thể và không gắn kháng thể. Các phức hợp được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo là những phức hợp cường độ phát quang rõ ràng và có gắn kháng thể.
2.8. Khảo sát khả năng phát hiện tác nhân gây bệnh của hạt NC–Ab trên chủng MRSA và E.coli O157: H7
- Các chủng chuẩn vi khuẩn Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis được nuôi cấy trong môi trường LB (Lubria broth) ở 370C, sau đó, được pha loãng bậc 10 thành nồng độ từ 102 CFU/ml (Shigella), 106 CFU/ml (Salmonella, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis).
- Hỗn dịch vi khuẩn (100 l) được cho phản ứng với 20 l các phức hợp A1, B1 với các thời gian từ 5, 15 phút đến 30 phút.
- Hỗn dịch được rửa hai lần với PBS. Hòa lại hỗn dịch trong 100 l PBS. - Sau đó, hỗn dịch được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
47
2.9. Ứng dụng hạt NC–Ab phát hiện chủng gây bệnh trên mẫu (giả mẫu)
• Vật liệu:
- Các mẫu thực phẩm mua từ chợ (30 mẫu bao gồm: rau muống, thịt bò, cải xanh....)
- Chủng chuẩn vi khuẩn E.coli O 157: H7, và MRSA
• Phương pháp:
1. Chọn mẫu thực phẩm:
Các mẫu thực phẩm được mua một cách ngẫu nhiên tại các chợ trong thành phố Hồ Chí Minh.
2. Kiểm tra mẫu thực phẩm:
Các mẫu sau khi mua từ chợ về được rửa sạch bằng dung dịch rửa rau quả. Cân 25 gram mẫu để tiến hành nuôi cấy.
Các mẫu không nhiễm vi khuẩn được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
3. Tiến hành giả mẫu:
- Chủng vi khuẩn được nuôi cấy vào môi trường LB
- Các chủng E.coli O 157: H7, và MRSA được pha loãng bậc 10 từ 101 – 108 CFU/ml vào trong các mẫu thực phẩm.
- Sau đó, cho 100 l phức hợp vào dịch đồng nhất mẫu có chứa vi khuẩn, tiến hành ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút.
- Thu 10 ml dung dịch đồng nhất, tiến hành ly tâm 8000 vòng/phút. - Loại bỏ dịch nổi và rửa 2 lần với PBS.
- Hòa lại cặn trong 100 l PBS.
- Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
4. Chụp hình TEM:
- Để so sánh kết quả huỳnh quang, chúng tôi tiến hành gửi các dung dịch phản ứng giữa vi khuẩn và phức hợp NC cho Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương để chụp hình nhằm quan sát hình dạng của mẫu khảo sát.
48
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Các vật liệu sau khi tổng hợp được nghiên cứu các tính chất hóa lý và cấu trúc của sản phẩm.
Để kiểm tra tính chất hóa lý:
-Mẫu được đo độ hấp thu hay phổ UV-Vis, để xác định độ hấp thu cực đại nhằm tìm ra bước sóng kích thích tốt nhất cho sự phát quang.
-Sự phát huỳnh quang được kiểm tra bằng máy huỳnh quang để kiểm tra phổ huỳnh quang PL để xác định hiệu suất huỳnh quang. Hiệu suất phát quang (PLQY) được tính bằng phương pháp so sánh dựa trên chất phát quang Rhodamine B.
Để kiểm tra cấu trúc của sản phẩm:
-Sản phẩm thu được được kết tinh lại trong dung môi isopropyl alcohol – IPA sau đó được rửa, lắng gạn nhiều lần, ly tâm, sấy khô trong chân không tại nhiệt độ phòng để thu hồi sản phẩm chất rắn cho việc phân tích cấu trúc, thành phần của các QD.
-Kiểm tra các nhóm chức trong sản phẩm bằng phổ hồng ngoại FT-IR, Raman. -Cấu trúc tinh thể được phân tích bằng nhiễu xạ tia X (X-ray).
-Xác định định lượng và thành phần nguyên tố của QDs bằng phổ tán sắc năng lượng tia X (EDS), phổ quang điện tử tia X (XPS).
-Hình dạng, kích thước của các hạt QDs được xác định bằng phương pháp chụp TEM.
- Các mẫu đại diện (mẫu được tổng hợp ở điều kiện có cường độ phát quang cao ứng với mỗi chất ổn định bề mặt trong giới hạn khảo sát của luận án) được đánh giá khả năng ứng dụng trong y sinh.
Phần A: Chất ổn định bề mặt axit 3-mercaptopropionic (MPA)
3.1. Phân tích cấu trúc và tính chất quang của nano phát quang ZnSe-MPA
3.1.1. Phân tích cấu trúc của nano phát quang ZnSe-MPA
Quy trình tổng hợp ZnSe-MPA được trình bày ở phần thực nghiệm (mục 2.2.1). Cấu trúc tinh thể ZnSe được xác định bởi kết quả XRD được thể hiện ở hình 3.1. Hình này cho thấy, thời gian và pH phản ứng trong điều kiện khảo sát của đề tài không ảnh hưởng nhiều đến sự hình thành pha tinh thể. Kết quả XRD (hình 3.1) minh chứng điều
49
này khi tất cả các mẫu ZnSe hình thành đều có cấu trúc lập phương tinh thể (cấu trúc giả kẽm – Zinc Blende) vì có các pic nhiễu xạ 27.50, 45.60 và 54.10 tương ứng với các mặt phẳng (111), (220), (311) phù hợp với thẻ chuẩn JCPDS 012-6803.
Hình 3.1. Nhiễu xạ XRD của ZnSe được tổng hợp ở nhiệt độ 900C, ở thời gian phản ứng và pH phản ứng khác nhau.
Kết quả này khá phù hợp với kết quả đã công bố của các nghiên cứu trước [75, 88, 180-182]. Tuy nhiên, thời gian và pH phản ứng có ảnh hưởng đến độ tinh thể hóa và độ tinh khiết của nano tinh thể (NC). Thời gian phản ứng tăng từ 2 đến 3 h (hình 3.1a) và pH tăng từ pH 3 đến pH 7 (hình 3.1b) thì cường độ pic nhiễu xạ tăng và sắc nét hơn. Có nghĩa là, khi thời gian và pH tăng thì độ tinh khiết, độ tinh thể hóa tinh thể tăng. Tuy nhiên, khi thời gian phản ứng tăng lên 4 h và pH tăng lên 9, pic nhiễu xạ có xu hướng giảm độ sắc nét. Điều này có thể được giải thích, khi giá trị pH tăng từ 3 đến 7 lực liên kết và năng lượng giới hạn Zn2+ tăng, dẫn đến sự hình thành của các NC nhiều hơn. Tuy nhiên, khi giá trị pH tăng cao hơn 7, thì Zn(OH)2 hình thành xen kẽ với bề mặt NC, làm sự suy giảm độ sắc nét [180, 183, 184]. Ngoài ra, khi thời gian phản ứng tăng lên (từ 1 h đến 3 h) thì làm tăng trưởng các hạt nano và làm cấu trúc ổn định hơn nhưng tiếp tục tăng thời gian phản ứng thì làm cho sự tăng kích thước, tạp chất trên bề mặt của các hạt nano [183].
Để kiểm tra các nhóm chức trong NC tiến hành đo phổ hồng ngoại FT-IR. Phổ FT-IR của MPA và mẫu ZnSe được tổng hợp ở pH 7 thời gian phản ứng 2 h, 3 h và 4 h (hình 3.2) cho thấy, pic tương ứng với số sóng 3400 cm-1 đặc trưng dao động của
50
liên kết O-H và nước hấp phụ bề mặt vật liệu [185]. Các pic tương ứng với số sóng 1700 cm-1 và 1720 cm-1 đặc trưng dao động của liên kết nhóm -C=O. Các pic tương ứng với số sóng 2550 cm-1 và 2650 cm-1 đặc trưng dao động của liên kết -S-H [145, 186-188]. Các pic tương ứng với số sóng 1110 cm-1 - 475 cm-1 đặc trưng dao động của liên kết Zn-S [189, 190].
Hình 3.2.Phổ FT-IR của QD ZnSe được tổng hợp ở nhiệt độ 900C, pH 7 và ở các thời gian phản ứng khác nhau.
Như vậy, đồng thời vẫn còn pic -OH và -C=O của nhóm -COOH của MPA và nhóm chức -S-H của MPA không còn chứng tỏ -SH đã hình thành liên kết trên bề mặt của tinh thể ZnSe và MPA đã liên kết được với các hạt quantum dots. Nhờ đó giúp tăng khả năng phân tán trong nước và giúp cho nó có những ứng dụng tốt trong sinh học, tương thích với tế bào sinh học hơn [180].
Từ kết quả này ta chọn điều kiện để tổng hợp lõi ZnSe là pH 7 và thời gian phản ứng là 3 h.
3.1.2. Phân tích tính chất quang của nano phát quang ZnSe-MPA
3.1.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tổng hợp đến sự phát quang của nano phát quang ZnSe-MPA
Tinh thể nano ZnSe-MPA được tổng hợp trong pha nước và có sử dụng MPA làm chất ổn định để hỗ trợ sự phân tán được trình bày ở mục 2.2.1. Ảnh hưởng của thời gian tổng hợp đến sự phát quang của nano phát quang ZnSe-MPA được kiểm tra
71
Phổ FT-IR của MPA và mẫu ZnSe/ZnS:Mn5%/ZnS (hình 3.34) cho thấy, các pic tương ứng với số sóng 3400 cm-1 và 3150 cm-1 đặc trưng dao động của liên kết O-H và nước hấp phụ bề mặt vật liệu [185]. Pic tương ứng với số sóng 2890 cm-1 đặc trưng dao động của liên kết nhóm -CH2. Các pic tương ứng với số sóng 1600 cm-1 và 1730 cm-1 đặc trưng dao động của liên kết nhóm carboxyl (-C=O). Pic tương ứng với số sóng 1600 cm-1 đặc trưng cho nhóm carboxyl (-C=O) của MPA trong môi trường trung tính đã bị dịch chuyển sang số sóng 1730 cm-1 trong môi trường kiềm. Các pic tương ứng với số sóng 2520 cm-1 và 2650 cm-1 đặc trưng dao động của liên kết -S-H [145, 187, 188]. Các pic tương ứng với số sóng 1110 cm-1 - 475 cm-1 đặc trưng dao động của liên kết Zn-S [189, 190].
Như vậy, đồng thời vẫn còn pic -OH và -C=O của nhóm -COOH của MPA và nhóm chức -S-H của MPA không còn chứng tỏ -SH đã hình thành liên kết trên bề mặt của tinh thể ZnSe và MPA đã liên kết được với các hạt NC. Các liên kết này giúp tăng khả năng phân tán trong nước và giúp cho nó có những ứng dụng tốt trong sinh học, tương thích với tế bào sinh học hơn [180].
Hình 3.35. Phổ UV-Vis của NC ZnSe/ZnS:Mn/ZnS-MPA ở những nồng độ pha tạp Mn khác nhau và của QD ZnSe:Mn-MPA, ZnSe:5%Mn/ZnS-MPA,
ZnSe/ZnS:5%Mn/ZnS-MPA.
Sự hấp thu của tinh thể nano ZnSe/ZnS:Mn/ZnS sử dụng chất ổn định MPA ở các nồng độ Mn2+/Zn2+ khác nhau được thể hiện ở (hình 3.35). Dựa vào phổ UV-Vis ta thấy rằng đỉnh hấp thu của các mẫu NC pha tạp Mn ở những nồng độ Mn2+/Zn2+
72
không đáng kể khi ta thay đổi hàm lượng Mn pha tạp. Vùng hấp thu quang của tinh thể nano ZnSe/ZnS:Mn/ZnS-MPA có bước sóng ≤ 401 nm.
Sự bọc thêm lớp vỏ đệm và lớp vỏ ZnS cũng làm thay đổi tính chất quang của vật liệu ZnSe:Mn-MPA. Kết quả phổ UV-Vis (hình 3.35a) cho thấy, bờ hấp thu quang của ZnSe/ZnS:Mn/ZnS-MPA chuyển dịch sang phía có bước sóng dài hơn so với ZnSe:Mn-MPA và ZnSe:Mn/ZnS-MPA.
Hình 3.36. Phổ PL của NCs ZnSe/ZnS:Mn/ZnS-MPA ở các nồng độ Mn2+ pha tạp khác nhau a) và NCs ZnSe:5%Mn-MPA, ZnSe:5%Mn/ZnS-MPA,
ZnSe/ZnS:5%Mn/ZnS-MPA b).
Sự phát quang của tinh thể nano ZnSe/ZnS:Mn/ZnS-MPA được thể hiện bằng phổ huỳnh quang PL (hình 3.36a). Hình này cho thấy, các hạt NC ZnSe/ZnS:Mn/ZnS ở những nồng độ Mn2+ pha tạp khác nhau có cường độ phát quang khác nhau. Cường độ phát quang tại tâm Mn2+ ở bước sóng 617 nm đạt lớn nhất khi nồng độ pha tạp Mn là 5%, tâm phát quang Mn2+ đóng vai trò chủ đạo trong tính chất phát quang của hạt.
Cường độ phát quang của hạt NC cấu trúc lõi/vỏ đệm/vỏ ZnSe/ZnS:Mn/ZnS- MPA lớn hơn các hạt nano cấu trúc lõi/vỏ ZnSe:Mn/ZnS-MPA và lớn hơn các hạt nano cấu trúc lõi ZnSe:Mn-MPA (hình 3.36b). Do trong các hạt nano cấu trúc lõi/vỏ đệm/vỏ ZnSe/ZnS:Mn/ZnS-MPA, ZnS đóng vai trò như lớp đệm, tác dụng của lớp đệm ZnS là làm giảm sự chênh lệch hằng số mạng giữa lớp lõi và lớp vỏ, từ đó làm giảm ứng suất tại các vùng tiếp giáp giữa lớp lõi và lớp vỏ, kết quả là làm giảm được các khuyết tật bề mặt chấm lượng tử do ứng suất gây nên, và sẽ làm tăng đáng kể hiệu suất huỳnh quang [151]. Hơn nữa, hiện tượng ion hoá NC sẽ không xảy ra, hàng rào
73
lớp vỏ dày bao quanh lõi nano tinh thể sẽ giới hạn các hạt tải bị bẫy bắt trên bề mặt và việc thêm một lớp vỏ của chất bán dẫn có độ rộng vùng cấm lớn hơn (như ZnS bọc lên trên CdSe) có thể làm tăng hiệu suất lượng tử và cải thiện độ bền của chúng [151, 158].
Hình 3.37. Ảnh chụp TEM và giản đồ phân bố kích thước hạt của QD ZnSe/ZnS:5%Mn/ZnS-MPA chất ổn định MPA.
Hình thái học bề mặt và kích thước hạt của ZnSe/ZnS:Mn5%/ZnS-MPA được thể hiện hình 3.37a. Hình 3.37a cho thấy các hạt ZnSe/ZnS:5%Mn/ZnS-MPA tựa hình cầu. Kích thước hạt ZnSe/ZnS:Mn/ZnS-MPA lớn hơn so với hạt ZnSe:Mn-MPA và ZnSe:Mn/ZnS-MPA. Giản đồ phân bố kích thước hạt của mẫu ZnSe/ZnS:5%Mn/ZnS- MPA (hình 3.37b) cho thấy các hạt ZnSe/ZnS:5%Mn/ZnS-MPA khá đồng đều.
Phổ XPS của ZnSe/ZnS:5%Mn/ZnS (hình 3.38) cho thấy sự hiện diện các nguyên tố có trong mẫu như Zn, Mn, O, C, và S. Trạng thái hóa học của các nguyên tố này được làm rõ thông qua phổ XPS với chế độ scan phân giải cao (hình 3.38). Trên hình ảnh phổ này cho thấy các pic tại 1021,5 eV và 1044,5 eV đặc trưng cho năng lượng liên kết của Zn-2p3/2 và Zn-2p1/2 tương ứng, đặc trưng cho năng lượng liên kết của Zn có trạng thái oxi hóa +2 [141, 216-220]. Pic tại 527,2 eV đặc trưng cho năng lượng liên kết của O 1s. Trạng thái C1s hiện diện tại các năng lượng liên kết 289,6 và 285,4 eV liên quan đến các liên kết C-OH và O-(C=O). Ở đây, các pic liên quan đến liên kết C-O và O-(C=O) trong mạng, có thể dự đoán rằng Zn có liên kết hóa học với C-O và C-OH [221]. Bên cạnh đó, các mức năng lượng liên kết 161,2 eV và 162,8 eV đặc trưng cho năng lượng liên kết của 2p3/2 và 2p1/2 tương ứng, đặc trưng cho năng lượng liên kết của S có trạng thái oxi hóa -2, đỉnh S-2p nằm ở 161,2 eV được quy cho liên kết Zn – S [216]. Mức năng lượng liên kết 640,2 eV đặc trưng cho năng lượng
74
Hình 3.38. Phổ XPS của ZnSe/ZnS:5%Mn/ZnS-MPA.
liên kết của Mn-2p3/2 tương ứng đặc trưng cho trạng thái oxi hóa +2 của mangan [75, 217, 222]. Cường độ của pic phổ Mn-2p3/2 yếu chứng tỏ hàm lượng của Mn2+ trong
75
mẫu ít. Như vậy, ion Mn2+ tồn tại trong mẫu ZnSe/ZnS:5%Mn/ZnS và mangan đã pha tạp thành công vào mạng tinh thể ZnS. Ion Mn2+ và Zn2+ có cùng điện tích và bán kính của chúng khác nhau không nhiều, vì thế ion Mn2+ dễ dàng thay thế các vị trí ion Zn2+
hoặc chiếm chỗ các lỗ trống cation trong mạng tinh thể.
Hình 3.39. Phổ PL của hạt nano ZnSe/ZnS:5%Mn/ZnS-MPA và Rhodamine B. Hiệu suất huỳnh quang của các hạt khi so với chất chuẩn Rhodamine B là 74,37%. Hiệu suất huỳnh quang của NC ZnSe/ZnS:5%Mn/ZnS-MPA lớn hơn so với hiệu suất huỳnh quang của mẫu ZnSe:Mn5%/ZnS-MPA là 55,04% và lớn hơn so với mẫu ZnSe:5%Mn-MPA chưa được bọc lớp vỏ ZnS là 32,69%.
Kết luận phần A
Đã khảo sát các điều kiện tổng hợp các hạt nano phát quang ZnSe-MPA, ZnSe:Mn-MPA, ZnSe:Mn/ZnS- MPA, ZnSe/ZnS:Mn/ZnS-MPA sử dụng chất ổn định là 3-Mercaptopropionic Axit (MPA). Lựa chọn được điều kiện phù hợp cho tổng hợp hạt nano có cường độ quang cao nhất là ZnSe/ZnS:Mn/ZnS-MPA cấu trúc lõi/vỏ/vỏ, cụ thể:
- Lõi ZnSe được tổng hợp ở pH 7, nhiệt độ 900C, thời gian phản ứng là 3 h. - Lớp ZnS:Mn được tổng hợp ở pH 11, nhiệt độ 900C, thời gian phản ứng là
1,5 h, tỷ lệ mol Mn2+/Zn2+ là 5%.
- Lớp ZnS được tổng hợp ở pH 11, nhiệt độ 800C, thời gian phản ứng là 1 h,