4. Bố cục và nội dung của luận án
2.5.6. Phổ quang điện tử ti aX (XPS)
XPS là kĩ thuật phân tích tính chất trên bề mặt vật liệu. Nó thường được dùng để xác định thành phần cơ bản, trạng thái hóa học, trạng thái điện tử của các nguyên tố trên bề mặt mẫu khác nhau của vật liệu. Bằng cách ghi lại năng lượng liên kết của các điện tử phóng ra từ một bề mặt mẫu, sau khi bề mặt mẫu bị chiếu bởi một tia X.
42
Mỗi nguyên tố đặc trưng một pic trên phổ. Khi biết năng lượng liên kết điện tử có thể suy ra nguyên tố, hàm lượng, trạng thái hóa học có mặt trong mẫu.
XPS đòi hỏi điều kiện chân không siêu cao nhằm ngăn chặn hiện tượng mất các electron lớp ngoài khi đặt trong không khí của một số chất liệu.
Ứng dụng chính của kỹ thuật phổ XPS là để nghiên cứu các phản ứng hóa học có thể phát sinh ở vài lớp nguyên tử ngoài cùng của bề mặt vật liệu [172].
Trong luận án này, phổ XPS được ghi nhận trên thiết bị AXIS SUPRA với một nguồn tia X đơn sắc của Al Kα (1486,6 eV). Mẫu được gửi đo tại phòng thí nghiệm Đại học Pusan Hàn Quốc.
2.5.7. Phương pháp hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
TEM là một thiết bị hữu ích trong việc nghiên cứu hình dạng, kích thước thực và sự phân bố của các QD thông qua việc chụp ảnh các QD.
Các ảnh TEM nhận được trên thiết bị JEM-1400 JEOL (Nhật) tại Đại học Bách khoa Tp HCM. Các mẫu chụp TEM được chuẩn bị bằng cách nhỏ dung dịch chứa các QD (QD phân tán trong nước) với nồng độ rất thấp lên một lưới đồng phủ carbon và sau đó để dung môi bay hơi. Các lưới đồng đã chuẩn bị được sấy khô trong với nồng độ rất thấp để tránh sự kết đám và có thể quan sát rõ hình dạng và kích thước của chúng [173].
Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM hoạt động dựa trên nguyên lý tương tự như kính hiển vi quang học. Do giới hạn của sự phân giải trong một vài amstrong (Å). Nó là một công cụ hữu dụng và mạnh mẽ cho đặc trưng của các hạt nano. Độ phân giải TEM có thể cung cấp thông tin về kích thước và hình dạng của mẫu.
2.5.8. Phương pháp phổ tán sắc năng lượng tia X (EDS).
Phổ tán sắc năng lượng tia X là kỹ thuật phân tích thành phần hóa học của vật rắn dựa vào việc ghi lại phổ tia X phát ra từ vật rắn do tương tác với các bức xạ. Các bức xạ này chủ yếu là chùm điện tử có năng lượng cao trong các kính hiển vi điện tử.
Kỹ thuật EDS chủ yếu được thực hiện trong các kính hiển vi điện tử ở đó, ảnh vi cấu trúc vật rắn được ghi lại thông qua việc sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao tương tác với vật rắn. Việc ghi nhận phổ tia X phát ra từ vật rắn sẽ cho thông tin
43
về các nguyên tố hóa học có mặt trong mẫu đồng thời cho các thông tin về tỉ phần các nguyên tố này.
Trong luận án này, phân tích định lượng thành phần các nguyên tố có trong mẫu được ghi nhận trên hệ EDAX, AMATEK gắn trên kính hiển vi điện tử quét nova nanosem 450 (fei) tại Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, ĐHQGHN.
2.5.9. Phổ tán xạ Raman
Tán xạ Raman là một phương pháp tốt để nghiên cứu tính chất dao động của vật liệu.
Các mẫu QD để đo phổ tán xạ Raman là mẫu rắn. Vì tín hiệu Raman thường rất yếu, do đó để có thể thu được phổ tán xạ Raman, mẫu sau khi chế tạo được li tâm nhiều lần để làm sạch các chất dư thừa không phản ứng và loại bỏ hết dung môi. Trong phép đo phổ tán xạ Raman thì mật độ công suất kích thích được giữ ở mức thấp để tránh hiện tượng đốt nóng mẫu [174].
Trong luận án này, phổ Raman đo ở nhiệt độ phòng được thực hiện trên hệ đo raman Xplora One 532 nm hãng Horiba Scientific tại Trung tâm thiết bị và phân tích Hóa lý Viện Khoa Học Vật Liệu và Ứng Dụng TPHCM. Hệ đo sử dụng laser kích thích là 532 nm, độ phân giải của hệ đo là 10 nm-1. Số cách tử sử dụng 1 (900 gr./mm) và khoảng ghi phổ từ 0 – 3600 cm-1, Filter 25%, thời gian quét 30 giây.
2.5.10. Hiệu suất lượng tử của các chấm lượng tử
Hiệu suất lượng tử (QY) huỳnh quang là tỷ lệ giữa số photon phát xạ trên số photon mà mẫu đã hấp thụ. Để xác định chính xác, người ta thường đo bằng hệ đo có quả cầu tích phân và mẫu phải ở dạng rắn hoặc bột. Tuy nhiên, đối với QD huyền phù thì không thể sử dụng theo cách này được, do đó QY của các QD được xác định tương đối bằng cách so sánh với chất phát quang có hiệu suất lượng tử đã biết trước, dùng làm chất chuẩn để so sánh, điển hình là các chất màu hữu cơ như Rhodamine, rhodamine 6G, fluorescein 27, và coumarin 153 [175-177].
Việc xác định tương đối QY của chất phát quang thường bao gồm các bước sau: thứ nhất, xác định phổ hấp thụ và phổ phát xạ của chất phát quang cần đo. Thứ hai, lựa chọn một chất phát quang làm mẫu chuẩn có phổ hấp thụ và phát quang có vùng bước sóng gần hoặc tương tự như mẫu, ngoài ra chất phát quang này cần phải biết các
44
điều kiện đo như dung môi, bước sóng kích thích, nhiệt độ. Thứ ba, lựa chọn các điều kiện đo như bước sóng kích thích quang huỳnh quang, độ hấp thụ tại bước sóng kích thích đó, thường là chỉnh ở độ hấp thụ của dung dịch cỡ 2,5 đến 3% mà thôi, để tránh việc tái hấp thụ hay truyền năng lượng hấp thụ giữa các hạt nằm quá gần nhau. Tiến hành đo phổ hấp thụ và phổ phát xạ của cùng mẫu đo này và mẫu chuẩn trong các dung môi tương ứng. Thứ tư, xử lý số liệu và tính toán hiệu suất lượng tử tương đối theo công thức sau [178, 179]:
f ,x và f,st tương ứng là QY của QD cần đo và của mẫu chuẩn.
Fx, Fst lần lượt là diện tích vùng phổ phát xạ của mẫu đo và mẫu chuẩn.
nx, nst : chỉ số khúc xạ trong dung dịch (cả hai cùng là dung dịch trong suốt trong dung môi nên tỉ số này chia nhau bằng 1).
fx, fst là phần hấp thụ bởi mẫu đo hoặc mẫu chuẩn.
Để kết quả tính QY chính xác thì bước sóng hấp thụ của các chất màu lựa chọn làm mẫu chuẩn và mẫu đo phải bằng nhau tại bước sóng kích thích hệ đo huỳnh quang, thì hiệu suất lượng tử được tính:
Fx, Fst được xác định bằng cách tính diện tích phổ phát xạ huỳnh quang của mẫu đo và mẫu chuẩn.
2.6. Đánh giá khả năng tương thích của nano phát quang với kháng thể bằng kỹ thuật SDS - pages. thuật SDS - pages.
Phương pháp:
• Chuẩn bị các phức hợp
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm giữa EDC, protein A và NCs ZnSe:5%Mn/ZnS-PEG
A A1 (l) A2 (l) A3 (l)
EDC [20mg/ml] 10 20 30
Protein A [2mg/ml] 25 25 25
45
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm giữa EDC, protein A và NCs ZnSe:5%Mn/ZnS-PEG
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm giữa EDC, protein A và NCs ZnSe:5%Mn/ZnS-PEG
(EDC: 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride)
• Chuẩn bị gel điện di
Đổ gel 16%, với các thành phần của gel phân tách và gel gom như bảng 2.6.
Bảng 2.6. Thành phần của gel phân tách và gel gom
Gel phân tách Gel gom
Thành phần Thể tích (μl) Thành phần Thể tích (μl) H2O 840 H2O 480 Tris-HCl 1,5M pH8,8 1500 Tris-HCl 0,5M pH6,8 500 Acrylamide: bisacrylamide (37:1) 2400 Acrylamide: bisacrylamide (2:1) 1000 SDS 10% 60 SDS 10% 20 APS (100mg/ml) 30 APS (100mg/ml) 15 TEMED 6 TEMED 3
(Ammonium persulphate (APS), N,N,N&,N&-tetramethylethylenediamine (TEMED)) Lần lượt đổ gel theo thứ tự: gel phân tách (separating gel) và gel gom (stacking gel). Sau khi gel đông, lấy lược ra, lắp bảng gel vào bồn điện di và cho dung dịch điện di 1X vào bồn.
• Chuẩn bị mẫu điện di
Lấy 15μl phức hợp NC – protein A – kháng thể hòa với 15μl dung dịch nạp mẫu điện di 2X. B B1 (l) B2 (l) B3 (l) EDC [20mg/ml] 10 20 30 Protein A [2mg/ml] 50 50 50 NCs 40 30 20 C C1 (l) C2 (l) C3 (l) EDC [20mg/ml] 5 10 20 Protein A [2mg/ml] 75 75 75 NCs 20 15 5
46
• Tiến hành điện di:
+ Nạp 15 μl mẫu phức hợp A, B, C vào mỗi giếng, tiến hành điện di với hiệu điện thế 120V, cường độ dòng điện 90mA, thời gian 120 phút.
+ Khi điện di xong, lấy gel ra khỏi kính, loại bỏ phần gel gom, nhuộm phần gel phân tách với dung dịch nhuộm khoảng 10 phút.
+ Giải nhuộm bằng dung dịch giải nhuộm, thay dần dung dịch giải nhuộm cho đến khi gel trở nên trong suốt không màu và vạch protein hiện rõ.
2.7. Tiến hành chạy flow cytometry xác định nồng độ tối ưu giữa tương tác kháng thể (Ab) và hạt nano phát quang (NC). thể (Ab) và hạt nano phát quang (NC).
• Vật liệu:
Các phức hợp đã gắn kháng thể cho từng tác nhân Kháng thể chuẩn của máy
• Phương pháp:
Phương pháp flow cytometry được tiến hành chạy trên máy BD FACSCalibur Calibrate
Các phức hợp gắn với kháng thể, sẽ được tiến hành xác định sự khác biệt giữa hạt QD có gắn kháng thể và không gắn kháng thể. Các phức hợp được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo là những phức hợp cường độ phát quang rõ ràng và có gắn kháng thể.
2.8. Khảo sát khả năng phát hiện tác nhân gây bệnh của hạt NC–Ab trên chủng MRSA và E.coli O157: H7
- Các chủng chuẩn vi khuẩn Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis được nuôi cấy trong môi trường LB (Lubria broth) ở 370C, sau đó, được pha loãng bậc 10 thành nồng độ từ 102 CFU/ml (Shigella), 106 CFU/ml (Salmonella, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis).
- Hỗn dịch vi khuẩn (100 l) được cho phản ứng với 20 l các phức hợp A1, B1 với các thời gian từ 5, 15 phút đến 30 phút.
- Hỗn dịch được rửa hai lần với PBS. Hòa lại hỗn dịch trong 100 l PBS. - Sau đó, hỗn dịch được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
47
2.9. Ứng dụng hạt NC–Ab phát hiện chủng gây bệnh trên mẫu (giả mẫu)
• Vật liệu:
- Các mẫu thực phẩm mua từ chợ (30 mẫu bao gồm: rau muống, thịt bò, cải xanh....)
- Chủng chuẩn vi khuẩn E.coli O 157: H7, và MRSA
• Phương pháp:
1. Chọn mẫu thực phẩm:
Các mẫu thực phẩm được mua một cách ngẫu nhiên tại các chợ trong thành phố Hồ Chí Minh.
2. Kiểm tra mẫu thực phẩm:
Các mẫu sau khi mua từ chợ về được rửa sạch bằng dung dịch rửa rau quả. Cân 25 gram mẫu để tiến hành nuôi cấy.
Các mẫu không nhiễm vi khuẩn được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
3. Tiến hành giả mẫu:
- Chủng vi khuẩn được nuôi cấy vào môi trường LB
- Các chủng E.coli O 157: H7, và MRSA được pha loãng bậc 10 từ 101 – 108 CFU/ml vào trong các mẫu thực phẩm.
- Sau đó, cho 100 l phức hợp vào dịch đồng nhất mẫu có chứa vi khuẩn, tiến hành ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút.
- Thu 10 ml dung dịch đồng nhất, tiến hành ly tâm 8000 vòng/phút. - Loại bỏ dịch nổi và rửa 2 lần với PBS.
- Hòa lại cặn trong 100 l PBS.
- Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
4. Chụp hình TEM:
- Để so sánh kết quả huỳnh quang, chúng tôi tiến hành gửi các dung dịch phản ứng giữa vi khuẩn và phức hợp NC cho Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương để chụp hình nhằm quan sát hình dạng của mẫu khảo sát.
48
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Các vật liệu sau khi tổng hợp được nghiên cứu các tính chất hóa lý và cấu trúc của sản phẩm.
Để kiểm tra tính chất hóa lý:
-Mẫu được đo độ hấp thu hay phổ UV-Vis, để xác định độ hấp thu cực đại nhằm tìm ra bước sóng kích thích tốt nhất cho sự phát quang.
-Sự phát huỳnh quang được kiểm tra bằng máy huỳnh quang để kiểm tra phổ huỳnh quang PL để xác định hiệu suất huỳnh quang. Hiệu suất phát quang (PLQY) được tính bằng phương pháp so sánh dựa trên chất phát quang Rhodamine B.
Để kiểm tra cấu trúc của sản phẩm:
-Sản phẩm thu được được kết tinh lại trong dung môi isopropyl alcohol – IPA sau đó được rửa, lắng gạn nhiều lần, ly tâm, sấy khô trong chân không tại nhiệt độ phòng để thu hồi sản phẩm chất rắn cho việc phân tích cấu trúc, thành phần của các QD.
-Kiểm tra các nhóm chức trong sản phẩm bằng phổ hồng ngoại FT-IR, Raman. -Cấu trúc tinh thể được phân tích bằng nhiễu xạ tia X (X-ray).
-Xác định định lượng và thành phần nguyên tố của QDs bằng phổ tán sắc năng lượng tia X (EDS), phổ quang điện tử tia X (XPS).
-Hình dạng, kích thước của các hạt QDs được xác định bằng phương pháp chụp TEM.
- Các mẫu đại diện (mẫu được tổng hợp ở điều kiện có cường độ phát quang cao ứng với mỗi chất ổn định bề mặt trong giới hạn khảo sát của luận án) được đánh giá khả năng ứng dụng trong y sinh.
Phần A: Chất ổn định bề mặt axit 3-mercaptopropionic (MPA)
3.1. Phân tích cấu trúc và tính chất quang của nano phát quang ZnSe-MPA
3.1.1. Phân tích cấu trúc của nano phát quang ZnSe-MPA
Quy trình tổng hợp ZnSe-MPA được trình bày ở phần thực nghiệm (mục 2.2.1). Cấu trúc tinh thể ZnSe được xác định bởi kết quả XRD được thể hiện ở hình 3.1. Hình này cho thấy, thời gian và pH phản ứng trong điều kiện khảo sát của đề tài không ảnh hưởng nhiều đến sự hình thành pha tinh thể. Kết quả XRD (hình 3.1) minh chứng điều
49
này khi tất cả các mẫu ZnSe hình thành đều có cấu trúc lập phương tinh thể (cấu trúc giả kẽm – Zinc Blende) vì có các pic nhiễu xạ 27.50, 45.60 và 54.10 tương ứng với các mặt phẳng (111), (220), (311) phù hợp với thẻ chuẩn JCPDS 012-6803.
Hình 3.1. Nhiễu xạ XRD của ZnSe được tổng hợp ở nhiệt độ 900C, ở thời gian phản ứng và pH phản ứng khác nhau.
Kết quả này khá phù hợp với kết quả đã công bố của các nghiên cứu trước [75, 88, 180-182]. Tuy nhiên, thời gian và pH phản ứng có ảnh hưởng đến độ tinh thể hóa và độ tinh khiết của nano tinh thể (NC). Thời gian phản ứng tăng từ 2 đến 3 h (hình 3.1a) và pH tăng từ pH 3 đến pH 7 (hình 3.1b) thì cường độ pic nhiễu xạ tăng và sắc nét hơn. Có nghĩa là, khi thời gian và pH tăng thì độ tinh khiết, độ tinh thể hóa tinh thể tăng. Tuy nhiên, khi thời gian phản ứng tăng lên 4 h và pH tăng lên 9, pic nhiễu xạ có xu hướng giảm độ sắc nét. Điều này có thể được giải thích, khi giá trị pH tăng từ 3 đến 7 lực liên kết và năng lượng giới hạn Zn2+ tăng, dẫn đến sự hình thành của các NC nhiều hơn. Tuy nhiên, khi giá trị pH tăng cao hơn 7, thì Zn(OH)2 hình thành xen kẽ với bề mặt NC, làm sự suy giảm độ sắc nét [180, 183, 184]. Ngoài ra, khi thời gian phản ứng tăng lên (từ 1 h đến 3 h) thì làm tăng trưởng các hạt nano và làm cấu trúc ổn định hơn nhưng tiếp tục tăng thời gian phản ứng thì làm cho sự tăng kích thước, tạp chất trên bề mặt của các hạt nano [183].
Để kiểm tra các nhóm chức trong NC tiến hành đo phổ hồng ngoại FT-IR. Phổ FT-IR của MPA và mẫu ZnSe được tổng hợp ở pH 7 thời gian phản ứng 2 h, 3 h và 4 h (hình 3.2) cho thấy, pic tương ứng với số sóng 3400 cm-1 đặc trưng dao động của
50
liên kết O-H và nước hấp phụ bề mặt vật liệu [185]. Các pic tương ứng với số sóng 1700 cm-1 và 1720 cm-1 đặc trưng dao động của liên kết nhóm -C=O. Các pic tương ứng với số sóng 2550 cm-1 và 2650 cm-1 đặc trưng dao động của liên kết -S-H [145, 186-188]. Các pic tương ứng với số sóng 1110 cm-1 - 475 cm-1 đặc trưng dao động của liên kết Zn-S [189, 190].
Hình 3.2.Phổ FT-IR của QD ZnSe được tổng hợp ở nhiệt độ 900C, pH 7 và ở các thời gian phản ứng khác nhau.
Như vậy, đồng thời vẫn còn pic -OH và -C=O của nhóm -COOH của MPA và