sinh do bất thường NST.
Kết quả của các xét nghiệm sàng lọc chỉ là bước khởi đầu xác định thai cĩ nguy cơ cao bất thường, phải cĩ phương pháp chẩn đốn xác định tiếp theo thì test sàng lọc mới cĩ hiệu quả. Đĩ là tiến hành làm các xét nghiệm di truyền. Các xét nghiệm này cĩ thể ở mức độ tế bào (phân tích NST), mức độ
phân tử (ADN) hoặc cả mức độ tế bào và phân tử (FISH). Tất cả các xét nghiệm di truyền này chỉ thực hiện được khi cĩ được tế bào cĩ nguồn gốc từ
thai. Người ta sử dụng các phương pháp khác nhau để lấy được tế bào thai, nhưng cĩ hai phương pháp chính đĩ là:
- Phương pháp lấy tế bào trực tiếp từ thai nhi. Tế bào thai được lấy phổ biến từ chọc hút dịch ối, chọc hút tua rau, ngồi ra cịn cĩ thể lấy tế bào thai qua chọc hút máu dây rốn, sinh thiết mơ thai, nội soi thai, hút tế bào qua cổ tử cung.
- Phương pháp lấy tế bào thai gián tiếp từ máu mẹ.
Ngày nay chọc hút dịch ối là phương pháp được lựa chọn nhiều nhất bởi vì thu được tế bào cĩ nguồn gốc từ thai giúp cho chẩn đốn di truyền cĩ kết quả
chính xác và là một trong những thủ thuật ít gây tai biến cho thai cũng như
cho mẹ.
* Những chỉđịnh cho chọc hút ối phân tích NST ối
- Tuổi mẹ ≥ 35 tuổi
- Tiền sử gia đình: Mẹ cĩ tiền sử
+ Sẩy thai, thai chết lưu, hoặc chết khi sinh. + Cĩ con bị dị tật
+ Đã cĩ con bị trisomy
+ Bố hoặc mẹ mang NST chuyển đoạn
- Kết quả test sàng lọc ở huyết thanh mẹ cĩ nguy cơ cao sinh con bị lệch bội.
* Chọc hút dịch ối [6].
Chọc hút dịch ối lần đầu tiên được Schatz sử dụng vào năm 1882 với mục đích hút bớt dịch ối ở thai đa ối. Trong những năm 1950 tiến hành chọc hút dịch ối để đánh giá trước sinh những thai bị tan máu, năm 1956 chọc hút dịch ối để xác định giới tính. Đến 1966 qua phân tích NST trong tế bào dịch
ối một trường hợp trisomy 21 đầu tiên đã được biết [48].
Chọc hút dịch ối ở ba tháng giữa của thai được thực hiện từ những năm 1970 và ngày càng trở thành phổ biến cho chẩn đốn trước sinh. Kỹ thuật này cĩ hiệu quả cao trong chẩn đốn những thai cĩ nguy cơ cao bị bất thường NST (hội chứng Down, Trisomy 18, Trisomy 13, Turner…).
Ở nhiều nước xác định nồng độ AFP trong dịch ối được coi là một test sàng lọc cĩ độ nhạy cao đối với thai bị dị tật ống thần kinh. Chọc hút ối cũng
được dùng đểđánh giá những tình trạng khác của thai như nhiễm trùng [22]. Chọc ối tuần thứ 15-18 là tiêu chuẩn vàng áp dụng cho chẩn đốn di truyền tế bào trước sinh với độ chính xác cao (99,4-99,8%) và cĩ tỷ lệ sẩy thai 0,5-1%. Phân tích karyotyp của tế bào ối cĩ kết quả sau khoảng 10-12 ngày.
Sau khi lấy được tế bào thai theo phương pháp trên, các tế bào thai đĩ
được dùng để chẩn đốn xác định thai cĩ bị dị tật bẩm sinh hay khơng ở mức
độ tế bào hoặc mức độ phân tử. Dưới đây chúng tơi trình bày tĩm tắt các kỹ
thuật đĩ.
* Phương pháp di truyền học tế bào (phương pháp xét nghiệm NST).
Để xét nghiệm NST người ta cĩ thể sử dụng phương pháp trực tiếp, tức là từ tế bào đang phân chia mạnh, khơng qua nuơi cấy như từ tế bào tua rau hoặc gián tiếp qua nuơi cấy.
Chọn mẫu tế bào nuơi cấy NST tuỳ thuộc vào từng trường hợp nhưng nhìn chung cĩ ba cách nuơi cấy:
- Nuơi cấy tế bào dịch ối.
- Nuơi cấy những tế bào mơ (tế bào tua rau, tế bào da thai, tế bào cơ thai.) - Nuơi cấy bạch cầu lympho với những mẫu máu thai.
Ởđây chúng tơi chỉ trình bày cách nuơi cấy tế bào dịch ối
* Nuơi cấy tế bào dịch ối.
Phân tích NST của tế bào nuơi cấy từ dịch ối được xem như là phương pháp thuận tiện nhất, tin cậy cho chẩn đốn trước sinh.
Dịch ối cĩ màu vàng nhẹ, trong gồm một hỗn hợp tế bào bong khơng
đồng nhất, phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của thai, cĩ thể từ tế bào màng
ối, từ da, từ đường tiết niệu, đường hơ hấp, từ đường tiêu hố, cĩ thể cĩ những tế bào máu mẹ, thậm chí cĩ cả tế bào máu thai trong dịch ối.
Lượng nước ối cần để xét nghiệm NST được chia đều vào hai lọ nuơi cấy. Do các tế bào nước ối là các tế bào bong nên nuơi cấy cần một chế độ đặc biệt như mơi trường Chang, Amnio Max để tạo các tế bào sợi bám dính vào mặt bình nuơi cấy. Nuơi cấy theo phương pháp hở trong tủ ấm 370C với 5% CO2 và 95% khơng khí cùng nguồn ẩm.
Thời gian trung bình để cĩ kết quả phân tích NST từ 10-12 ngày.
Các phương pháp di truyền học phân tử.
+ Kỹ thuật lai tại chỗ (FISH: Fluorescence In Situ Hybridization)[6], [39],[12].
FISH là kỹ thuật lai giữa kỹ thuật tế bào và kỹ thuật phân tử, dùng một trình tự ngắn của chuỗi ADN sợi đơn, được gọi là mẫu ADN dị (các mẫu ADN dị này được đánh dấu bằng các đồng vị phĩng xạ). Các mẫu ADN dị này được lai với trình tự của ADN trên tiêu bản NST ở kỳ giữa, kỳ đầu hoặc gian kỳ. Qua sự lai của mẫu ADN dị với trình tự bổ sung ta cĩ thể phát hiện,
định vị được chuỗi ADN đặc hiệu qua phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang để xác định các bất thường của NST. Ưu điểm của kỹ thuật FISH là phát hiện nhanh chĩng những bất thường NST trong vịng 24 – 48 giờ do sử
dụng trực tiếp tế bào ối, tế bào tua rau khơng cần qua nuơi cấy. FISH cĩ thể
phát hiện các rối loạn NST nhỏ, các đột biến gen mà phương pháp phân tích NST khơng phát hiện được.
+ Phương pháp nhân bản ADN in vitro hay phản ứng chuỗi polymerase PCR (polymerase chain reaction)[12],[53],[48].
Trong chẩn đốn trước sinh PCR được dùng để chẩn đốn các hội chứng: hội chứng Down, hội chứng Edwards, hội chứng Turner và một số
bệnh khác như bệnh teo cơ Duchenne, bệnh xơ nang…vv.
Như vậy cĩ rất nhiều phương pháp khác nhau để lấy được tế bào cĩ nguồn gốc từ thai. Nhưng phương pháp hay được sử dụng nhiều nhất là phương pháp nuơi cấy tế bào ối để phân tích NST do cĩ nhiều ưu điểm như
trên đã nêu và giá thành xét nghiệm được chấp nhận nhiều hơn so với các kỹ
thuật khác như kỹ thuật FISH, kỹ thuật PCR. Trong nghiên cứu này chúng tơi chỉ sử dụng phương pháp phân tích NST qua tế bào ối nuơi cấy để phát hiện bất thường di truyền.
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU