Phƣơng pháp phân tích ADN ty thể đƣợc sử dụng để xác định chính xác tên các loài mối hại chính và để kiểm tra một số mẫu mối có đặc điểm hình thái tƣơng đối giống nhau, nhƣng có một vài điểm sai khác khó xác định là cùng loài hay khác loài. Một phần gen cytochrome oxidase II của ty thể (COII) đƣợc sử dụng theo phƣơng pháp của Miura et al., 1998 [82], vì đây là gen bảo thủ và có tỷ lệ tiến hóa thích hợp cho nghiên cứu quan hệ ở bậc giống, loài và quần thể.
Đoạn ADN 1000 bp gồm vùng mã hóa COI, tRNA-Leu, COII và tRNA-Lys. Mồi xuôi CI-J-2773: 5’-ATA CCT CGA CC(AT) TAT TCA GA-3’ (2773-2792) Mồi ngƣợc B-tLys: 5’-GTT TAA GAG ACC AGT ACT TG-3’ (3784-3804) Mồi khác cũng đƣợc sử dụng:
35
- Tách ADN tổng số: ADN tổng số đƣợc tách từ phần đầu hoặc phần đầu và ngực của từng cá thể mối lính hoặc mối thợ, sử dụng bộ Qiagen Mollusc DNA Kit. Cá thể mối sau khi cho bay hết cồn đƣợc chuyển vào ống li tâm 1,5 ml vô trùng chứa 180 µl buffer ATL, nghiền kỹ và bổ sung 20 µl Proteinase K, trộn đều bằng máy voltex rồi ủ ở 560C trong 45 phút. Sau đó thêm 150 µl buffer AL, ủ ở 700
C trong 10 phút. Thêm 120 µl ethanol 100%. Chuyển toàn bộ dịch mẫu sang cột Dneasy Mini Spin đặt trong ống thu dịch li tâm và li tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần dịch. Bổ sung lần lƣợt 400 µl buffer AW1 và AW2 vào cột li tâm, li tâm ở 14000 vòng/phút trong 1 phút để rửa ADN. Cuối cùng bổ sung 40 µl buffer AE, ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút rồi li tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút để thu ADN tổng số. ADN tổng số đƣợc bảo quản ở -200C.
- Phản ứng PCR:
Thành phần của phản ứng PCR nhƣ sau: 40 µl gồm 2 µl ADN tổng số, 30 µl nƣớc cất, 4 µl 10X PCR buffer, 100mM Tris-HCl (pH 8,3), 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 0,01% gelatin, 4 µl dNTP mix (1 mM mỗi loại dNTP), 0,2 µl mỗi mồi (100pM), 0,7 U Taq ADN polymerase (Takara,Tokyo).
Chu trình phản ứng PCR gồm các bƣớc: biến tính 450C trong 1 phút, 35 vòng chu kì gồm 940C trong 30 giây, 650C trong 3 phút, cuối cùng làm lạnh ở 40C. Sau khi phản ứng kết thúc, điện di 5 µl sản phẩm PCR trên agarose gel 1% để kiểm tra, phần còn lại bảo quản ở -200C.
- Tinh sạch ADN và giải trình tự:
Các sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch sử dụng QiAGEN Purification Kit. Mẫu đƣợc giải trình tự gen tại Khoa Côn trùng học, Đại học California Riverside, Mỹ. Phản ứng giải trình tự đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp dideoxy-nucleotide sử dụng Dye-Terminater Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer, Warrington, UK và Gen Amp 2400 thermal cycler). Điện di sản phẩm trên polyacrylamide gel 6%. Đọc trình tự gen trên máy automatic AND sequencer. Việc so sánh trình tự nucleotide của vùng gen COII đƣợc thực hiện cho các trình tự gen mối Việt Nam và các trình tự tƣơng ứng của Ngân hàng gen NCBI. Quá trình so sánh này đƣợc thực hiện bằng
36
phần mềm “Genious 7.1.5, bởi công ty Biomatters Ltd”. Mô hình Tamura và Nei đƣợc sử dụng để xác định khoảng cách di truyền. Phƣơng pháp Neighbor-joining đƣợc sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài. Phân tích bootstrap (lặp lại 1000 lần) đƣợc sử dụng để đánh giá mức độ tin cậy của các nhánh cây phát sinh loài.