5. Dự kiến kết quả đạt được
1.3.3. Ứng dụng của glucomannan
Nhờ những tính chất sinh, lý, hóa đặc biệt mà glucomannan và dẫn xuất của glucomannan đã được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như: công nghiệp thực phẩm; công nghệ sinh học; y sinh và dược phẩm; hoá học và một số lĩnh vực khác [33], [45], [54].
Trong y tế:
- Khả năng chống lão hóa: glucomannan thông qua một số phản ứng phức tạp có thể trực tiếp loại bỏ các gốc tự do của quá trình oxi hóa. Ngoài ra còn có thể thông qua enzim superoxide dismutase và hoạt tính của polyphenol oxidase
để kích hoạt chất glutathione, giảm hàm lượng phân tử MDA trong gan, do đó nó có khả năng rất mạnh trong việc phá hủy các gốc tự do bên ngoài cơ thể và bảo vệ các tổn hại đến gen [51].
- Tác dụng hạ đường huyết: glucomannan có chất xơ không bị hệ thống tiêu hóa hấp thụ, không có calo, thêm vào đó là đặc tính giảm bớt và kéo dài sự hấp thụ đường glucose, đây cũng là loại thuốc bổ sung rất tốt dành cho những người bị bệnh tiểu đường [51], [52].
- Điều tiết sự chuyển hóa lipid: glucomannan có thể làm giảm nồng độ cholesterol trong máu, vừa có thể giảm cả nồng độ glyceride. Khi lipid máu trở về trạng thái bình thường thì có thể điều tiết được sự chuyển hóa lipid [41].
- Tác dụng giảm mỡ máu, chống gan nhiễm mỡ: trong đường ống tiêu hóa, glucomannan kết hợp được với cholesterol, cản trở sự hấp thụ của mỡ trung tính và cholesterol, ngăn chặn acid cholic trong quá trình tuần hoàn của ruột và gan, mà quá trình tuần hoàn của ruột và gan khống chế quá trình cholesterol chuyển thành acid cholic [41].
Trong công nghiệp thực phẩm:
Dùng để tạo chất làm đặc, chất ổn định, tạo gel, làm màng có thể hòa tan: làm màng đóng gói thực phẩm không độc hại. Chất bảo quản thực phẩm, thực phẩm chức năng và phụ gia thực phẩm [21].
1.4.Các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng glucomannan
1.4.1. Phương pháp dùng thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic axit (3,5-DNS)
Phản ứng thủy phân glucomannan sẽ tạo thành hai loại đường khử là D-mannan và D-glucose. Các đường khử này sẽ chuyển thành hợp chất amino có màu đỏ nâu khi đun sôi với 3,5-DNS trong môi trường kiềm. Ở một mức độ nào đó, lượng đường khử là tỷ lệ thuận với cường độ màu được đo bằng phương pháp quang phổ kế.
Xây dựng đường chuẩn glucose và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 550 nm của dãy dung dịch chuẩn.
Hàm lượng glucomannan trong mẫu thử được tính theo công thức:
500 5 (%) 0f – m T A To (1.1) Trong đó:
T: hàm lượng glucose trong dung dịch glucomannan sau thủy phân. To: hàm lượng glucose trong dung dịch glucomannan trước thủy phân. f: hệ số hiệu chỉnh.
m: khối lượng mẫu thử [16], [40].
1.4.2. Phương pháp so màu phenol-sunfuric axit
Xây dựng đường chuẩn D-glucose và D-manose và tiến hành đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 490 nm.
Hàm lượng glucomannan được xác định theo công thức: 1 2 100 (%) fC G C (1.2) Trong đó: f: hệ số hiệu chỉnh.
C1: nồng độ đường glucose khi thủy phân glucomannan (µg/ml). C2: nồng độ dung dịch mẫu glucomannan (µg/ml) [40].
1.4.3. Phương pháp so màu enzim
D-glucose, D-mannose hoặc D-fructose được loại bỏ bằng dung dịch etanol (80 %) trong bước chuẩn bị mẫu. Các phản ứng enzim đầu tiên liên quan đến việc khử polime của acetyl-glucomannan bằng endo-β-mannanase để sản xuất acetylated glucomanno-oligosaccharides. Sau khi khử polime thành acetyl glucomano-oligosaccharides, các oligosaccharides được khử actyl bằng cách xử lý ở pH cao. Glucomanno-oligosaccharides thu được được thủy phân D- glucose (D-GLC) và D-mannose (D-Man) do tác động kết hợp của β- glucosidase và β-mannosidase. D-glucose và D-mannose sau đó được phosphoryl hóa bởi enzim và adenosine-5-triphosphate (ATP) thành glucose-6- phosphate (GLC-6-P) và mannose-6-phosphate (Man-6-P) tương ứng, với sự hình thành đồng thời của adenosine-5-diphosphate. Khi có mặt enzim GLC-6-P dehydrogenase, GLC-6-P bị oxi hóa bởi nicotinamide adenine dinucleotide- phosphate (NADP+) thành gluconate-6-phosphate với sự hình thành của NADP (NADPH). Lượng NADPH hình thành trong phản ứng này cân bằng với lượng D-glucose, NADPH được đo bằng sự gia tăng độ hấp thụ ở 340 nm. Khi kết thúc các phản ứng, Man-6-P được chuyển thành fructose-6-phosphate và sau đó thành GLC-6-P bằng các phản ứng của isomerase phosphomannose và isomerase phosphoglucose. GLC-6-P phản ứng với NADP+ hình thành gluconate-6- phosphate và NADPH [40].
Ngoài ra, hàm lượng glucomannan còn được xác định bằng một số phương pháp khác như phương pháp HPLC [58], sắc kí bản mỏng, sắc kí khí [12], [56].
Phương pháp so màu sử dụng chất hiện màu là 3,5-DNS được đánh giá có độ ổn định, độ lặp lại và độ chính xác cao.
Ở Việt Nam, hiện nay chỉ có một công bố về kết quả xác định hàm lượng glucomannan trong củ của loài Amorphophallus konjac K.Koch thu hái tại Hà Giang [16] mà chưa có một công bố nào về việc xây dựng phương pháp định lượng glucomannan một cách hoàn chỉnh và đánh giá được chất lượng của
phương pháp đó. Trong đề tài này, chúng tôi xây dựng phương pháp định lượng glucomannan bằng phương pháp so màu sử dụng chất hiện màu là 3,5-DNS và đánh giá chất lượng của phương pháp qua các yếu tố như giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện, độ lặp lại, độ chính xác…. Đồng thời ứng dụng phương pháp này để xác định hàm lượng glucomannan trong một số loài Nưa thu hái tại Việt Nam.
Chƣơng 2 THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Các mẫu củ Nưa Amorphophallus konjac K.Koch (Nưa konjac),
Amorphophallus krausei Engl.&Gehrm (Nưa krausei) và Amorphophallus
yuloensis H.Li (Nưa vân nam) có nguồn gốc Hà Giang, Sơn La, Hòa Bình và
hiện đang được trồng tại Tây Nguyên được thu hái vào mùa tạo củ tháng 10 năm 2015.
2.2. Nghiên cứu xây dựng qui trình xác định hàm lƣợng glucomannan trong bột Nƣa
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu xây dựng qui trình xác định hàm lượng glucomannan trong bột củ Nưa dựa trên phương pháp so màu với chất hiện màu 3,5-DNS.
2.2.1. Hóa chất và thiết bị xử lý mẫu
Hóa chất: natri hydro sulfit (NaHSO3) 0,2‰, etanol (C2H5OH), nước.
Thiết bị: máy xay, tủ sấy, máy nghiền.
2.2.2. Hóa chất và thiết bị xác định hàm lượng glucomannan trong bột củ Nưa
Hóa chất:
Glucose chuẩn ≥ 99,9% đạt chất lượng phân tích của hãng Sigma-Aldrich, USA. Glucomannan chuẩn ≥ 99,5% xuất sứ Trung Quốc.
Axit formic (HCOOH); kali natri tartrate (KNaC4H4O6.4H2O); phenol (C6H5OH) tinh khiết; 3,5-dinitrosalicylic axit (3,5-DNS); natri hydro sulfit (NaHSO3); natri hydroxyt (NaOH); axit sulfuric (H2SO4); etanol (C2H5OH) 96o; nước cất đều đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.
Thiết bị:
Cân phân tích 5 số AE 260S.
Máy đo quang phổ và hấp thụ nguyên tử khả kiến 40BU – Specord 40. Máy ly tâm (>4000 vòng/phút).
Pipet, bình tam giác, cốc thủy tinh, bình ổn nhiệt.
2.2.3. Chuẩn bị các điều kiện phân tích và cách tiến hành xây dựng qui trình xác định hàm lượng glucomannan trong bột Nưa xác định hàm lượng glucomannan trong bột Nưa
2.2.3.1. Xử lý mẫu thực vật
Củ Nưa sau khi thu hái đem rửa sạch đất cát, hong gió khoảng 20 - 30 phút, cân khối lượng củ, sau đó gọt bỏ vỏ. Phần lõi đem thái thành những lát mỏng 2 - 3 mm, nhúng vào dung dịch NaHSO3 0,2o/oo (chống nâu hóa), vớt ra rồi sấy ở 100ºC trong 30 phút rồi tiếp tục sấy ở 60ºC đến khô kiệt, sau đó nghiền thành bột mịn kích thước khoảng 400 - 500 µm thu được bột Nưa khô. Bột Nưa khô này được dùng để định lượng glucomannan bằng phương pháp so màu.
2.2.3.2. Chuẩn bị dung dịch thuốc thử
a) Dung dịch thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic axit (3,5-DNS)
Điều chế dung dịch A: Cân 0,7 gam C6H5OH cho vào 5 ml nước cất, thêm tiếp 1,5 ml dung dịch NaOH 10% và 0,7 gam NaHSO3, hòa tan hoàn toàn thu được dung dịch A.
Điều chế dung dịch B: Cân 22,5 gam KNaC4H4O6.4H2O cho vào cốc đong dung tích 200 ml, thêm tiếp 30 ml dung dịch NaOH 10% và 88 ml dung dịch 3,5-DNS 1%, khuấy đều thu được dung dịch B.
Trộn đều hỗn hợp dung dịch A và dung dịch B được dung dịch thuốc thử 3,5-DNS.
b) Dung dịch đệm HCOOH - NaOH 0,1 mol/lít
Lấy 1 ml dung dịch HCOOH vào bình định mức 250 ml đã hiệu chuẩn có chứa sẵn 60 ml nước cất, thêm vào 0,25 gam NaOH, hòa tan rồi định mức đến vạch bằng nước cất.
2.2.3.3. Điều kiện phân tích và tiến hành a) Xây dựng đường chuẩn glucose
Cân 1,0 gam glucose chuẩn, chính xác đến 0,001 gam vào bình định mức dung tích 1 lít đã được hiệu chuẩn, định mức đến vạch bằng nước cất, thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1 mg/ml.
Lấy lần lượt 0,4 ml; 0,8 ml; 1,2 ml; 1,6 ml và 2,0 ml dung dịch chuẩn gốc vào các bình định mức 25 ml đã được hiệu chuẩn, thêm 2,0 ml nước cất, tiếp đó thêm 1,5 ml thuốc thử 3,5-DNS vào mỗi bình.
Mỗi hỗn hợp được tạo phản ứng màu bằng cách làm nóng trong bể điều nhiệt ở 100ºC trong 5 phút rồi làm nguội đến nhiệt độ phòng. Định mức đến vạch bằng nước cất, thu được dãy dung dịch chuẩn glucose với nồng độ tương ứng: 16,0 µg/ml; 32,0 µg/ml; 48,0 µg/ml; 64,0 µg/ml; 80,0 µg/ml.
Đo độ hấp thụ quang của dãy dung dịch chuẩn ở bước sóng 550 nm. Ghi lại cường độ hấp thụ của dung dịch glucose tại các nồng độ khác nhau. Vẽ đường cong tiêu chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ glucose (trục Ox) vào cường độ hấp thụ (trục Oy).
b) Chuẩn bị dung dịch thử (dịch chiết glucomannan)
Cân 0,2 gam mẫu thử chứa glucomannan, chính xác đến 0,01 gam vào bình tam giác dung tích 100 ml đã chứa sẵn 50 ml dung dịch đệm HCOOH – NaOH, sau đó đem khuấy và để dung dịch trương nở ở nhiệt độ 30ºC trong 4 giờ hoặc ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Định mức đến 100 ml bằng dung dịch đệm HCOOH – NaOH, rồi ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút ở 25ºC, loại bỏ phần cặn thu được dung dịch thử glucomannan.
c) Thủy phân dung dịch thử glucomannan
Lấy chính xác 5 ml dung dịch thử glucomannan cho vào bình định mức 25 ml đã được hiệu chuẩn. Thêm chính xác 2,5 ml dung dịch H2SO4 3M, khuấy đều dung dịch, sau đó tiến hành thủy phân bằng cách thủy ở nhiệt độ 100ºC trong
thời gian 150 phút. Làm nguội dung dịch đến nhiệt độ phòng, sau đó thêm 2,5 ml dung dịch NaOH 6M, lắc đều rồi định mức đến vạch chuẩn bằng nước cất.
d) Tiến hành đo độ hấp thụ
Dùng pipet lấy lần lượt 2,0 ml dung dịch thử glucomannan, dung dịch thử glucomannan đã được thủy phân cho vào hai bình định mức 25 ml và một bình định mức chứa nước cất. Thêm 1,5 ml dung dịch thuốc thử 3,5-DNS vào mỗi bình, phản ứng màu bằng cách làm nóng trong bể điều nhiệt ở 100ºC trong 5 phút, sau đó làm nguội nhanh đến nhiệt độ phòng, định mức đến vạch chuẩn bằng nước cất.
Dung dịch được đem đo quang ở bước sóng 550 nm bằng máy UV – VIS. Sử dụng mẫu trống là nước cất. Hàm lượng glucose tương ứng với cường độ màu có thể tính toán dựa trên đường chuẩn hoặc theo phương trình hồi quy.
2.2.3.4. Tính toán kết quả
Hàm lượng glucomannan trong mẫu thử được tính theo công thức:
€ 5 – 50 1000 100 F T To M A (2.1) Trong đó:
A: hàm lượng glucomannan trong mẫu thử (%).
€: tỷ lệ giữa khối lượng phần glucose liên kết trong phân tử glucomannan và khối lượng phân tử glucose tạo thành sau thủy phân; € ≈ 0,9.
T: hàm lượng glucose trong dung dịch glucomannan sau khi thủy phân. To: hàm lượng glucose trong dung dịch glucomannan trước khi thủy phân. F: hệ số tương quan giữa nồng độ glucose và nồng độ glucomannan.
2.3. Khảo sát sự thích nghi của một số loài thuộc chi Amorphophallus tại một số vùng ở Tây Nguyên và lập hồ sơ thu mẫu một số vùng ở Tây Nguyên và lập hồ sơ thu mẫu
Việt Nam có hơn 20 loài thuộc chi Amorphophallus nhưng chỉ có ba loài phổ biến hơn cả, bao gồm Amorphophallus konjac K.Koch (Nưa konjac),
Amorphophallus krausei Engl.&Gehrm (Nưa krausei) và Amorphophallus
yuloensis H.Li (Nưa vân nam). Chúng tôi tiến hành thu thập mẫu củ Nưa tại
một số tỉnh như Hà Giang, Sơn La, Hòa Bình sau đó lựa chọn được ba loài ký hiệu lần lượt là M1, M2 và M3 để gây trồng tại Tây Nguyên. Lập hồ sơ thu mẫu được tiến hành theo các phương pháp dưới đây:
Phƣơng pháp thu thập thông tin
Tập hợp, phân tích và đánh giá các tài liệu khoa học, sách, các tạp chí chuyên ngành có liên quan để xác định cụ thể đối tượng và khu vực điều tra thu thập. Đây là cơ sở để lên kế hoạch cho các chuyến điều tra và thu mẫu ngoài thực địa.
Phƣơng pháp nghiên cứu ngoài thực địa
Điều tra và thu mẫu ngoài thực địa: Trên cơ sở các tài liệu nghiên cứu về
chi Amorphophallus hiện có ở Việt Nam, kết hợp với những khảo cứu sơ bộ,
chúng tôi đã tiến hành chọn các tuyến và địa điểm đại diện để điều tra và thu mẫu phục vụ cho nghiên cứu. Ngoài ra, để có thêm thông tin về đối tượng nghiên cứu, phương pháp điều tra có sự tham gia như đánh giá nông thôn có sự tham gia (PRA-Participatory Rural Appraisal) cũng được sử dụng để thu thập thêm thông tin cũng như thu thập kiến thức bản địa về sử dụng Nưa. Tuyến điều tra thường xuyên qua các môi trường sống của đối tượng thực hiện, nghĩa là các tuyến đó cắt ngang các vùng đại diện cho khu vực nghiên cứu.
Đối với mẫu dùng cho phân loại: mỗi mẫu thu có đầy đủ các bộ phận
như lá (lá non, lá trưởng thành), hoa (chùm hoa) và quả (quả non, quả già có hạt)… kích thước mẫu khoảng từ 35 - 42 cm, được đặt trong các tờ giấy báo. Mỗi một cá thể loài thu từ 4 - 8 mẫu. Các mẫu thu trên cùng một cây thì đánh
dấu cùng một số hiệu mẫu, các mẫu thu cùng loài nhưng khác cây thì đánh dấu khác số hiệu mẫu.
Đối với mẫu dùng cho xác định hàm lượng hoạt chất: thu củ, sau đó tiến
hành xử lý sơ bộ, cho vào túi nilon (có dán nhãn) rồi mang về phòng thí nghiệm để tiếp tục nghiên cứu.
Xử lý mẫu sơ bộ ngoài thực địa: để tránh hư hỏng, các mẫu thu được xử
lý sơ bộ ngoài thực địa.
Phƣơng pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
Xử lý và giám định tên: mẫu sau khi mang về phòng thí nghiệm được sấy
ngay. Trước khi sấy thay giấy báo mới và bó chặt bằng cặp gỗ rồi cho vào tủ sấy. Khi sấy mẫu được dựng đứng để nước bốc hơi dễ dàng và mẫu chóng khô. Để giám định tên thực vật, giá trị làm thuốc, dạng sống, chúng tôi sử dụng một số tài liệu như: Cây cỏ Việt Nam (Phạm Hoàng Hộ, 2000), Thực vật chí Đông Dương (Flore générale de I’ Indo-chine, H, Lecomle), Từ điển cây thuốc Việt Nam của Võ Văn Chi (1997), Cây thuốc và động vật làm thuốc của Viện dược liệu (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam của Đỗ Tất Lợi (2009),...
Phƣơng pháp phân tích đối chiếu
So sánh điều kiện môi trường nơi thu thập mẫu để đánh giá, thành phần loài Nưa phù hợp cho việc trồng thử nghiệm tại Tây Nguyên.
2.4. Xác định hàm lƣợng glucomannan trong một số loài Nƣa thu đƣợc
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát và thu thập được ba mẫu M1:
Amorphophallus konjac K.Koch, M2: Amorphophallus krausei Engl.&Gehrm
và M3: Amorphophallusyuloensis H.Li.
Cách xử lý mẫu:
Tiến hành xử lý mẫu như mục 2.2.3.1.
Xác định hàm lượng glucomannan trong bột Nưa:
2.5. Xác định hàm lượng glucomannan trong một số chế phẩm bột Nưa
Cách chế biến sản phẩm bột Nưa thực hiện theo sơ đồ 2.1 dưới đây:
Sơ đồ 2.1: Qui trình chế biến chế phẩm bột Nƣa
Củ Nưa sau khi được thu hái đem rửa sạch sau đó gọt bỏ vỏ. Thái củ Nưa
thành từng lát mỏng 1 - 2 mm rồi nhúng vào dung dịch NaHSO3 0,2‰, vớt ra
và dùng máy xay nghiền ướt với dung môi etanol:nước (1,5:1). Lọc bỏ dịch, phần còn lại đem ly tâm để thu tủa. Tủa thu được đem sấy lạnh rồi nghiền mịn thu được bột Nưa. Bột Nưa thu được đem nghiền và ly tâm lặp lại 3 lần sẽ thu được bột Nưa kỹ thuật, khi thực hiện nghiền và ly tâm lặp lại 5 lần sẽ thu được