5. Dự kiến kết quả đạt được
2.2.3. Chuẩn bị các điều kiện phân tích và cách tiến hành xây dựng qu
xác định hàm lượng glucomannan trong bột Nưa
2.2.3.1. Xử lý mẫu thực vật
Củ Nưa sau khi thu hái đem rửa sạch đất cát, hong gió khoảng 20 - 30 phút, cân khối lượng củ, sau đó gọt bỏ vỏ. Phần lõi đem thái thành những lát mỏng 2 - 3 mm, nhúng vào dung dịch NaHSO3 0,2o/oo (chống nâu hóa), vớt ra rồi sấy ở 100ºC trong 30 phút rồi tiếp tục sấy ở 60ºC đến khô kiệt, sau đó nghiền thành bột mịn kích thước khoảng 400 - 500 µm thu được bột Nưa khô. Bột Nưa khô này được dùng để định lượng glucomannan bằng phương pháp so màu.
2.2.3.2. Chuẩn bị dung dịch thuốc thử
a) Dung dịch thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic axit (3,5-DNS)
Điều chế dung dịch A: Cân 0,7 gam C6H5OH cho vào 5 ml nước cất, thêm tiếp 1,5 ml dung dịch NaOH 10% và 0,7 gam NaHSO3, hòa tan hoàn toàn thu được dung dịch A.
Điều chế dung dịch B: Cân 22,5 gam KNaC4H4O6.4H2O cho vào cốc đong dung tích 200 ml, thêm tiếp 30 ml dung dịch NaOH 10% và 88 ml dung dịch 3,5-DNS 1%, khuấy đều thu được dung dịch B.
Trộn đều hỗn hợp dung dịch A và dung dịch B được dung dịch thuốc thử 3,5-DNS.
b) Dung dịch đệm HCOOH - NaOH 0,1 mol/lít
Lấy 1 ml dung dịch HCOOH vào bình định mức 250 ml đã hiệu chuẩn có chứa sẵn 60 ml nước cất, thêm vào 0,25 gam NaOH, hòa tan rồi định mức đến vạch bằng nước cất.
2.2.3.3. Điều kiện phân tích và tiến hành a) Xây dựng đường chuẩn glucose
Cân 1,0 gam glucose chuẩn, chính xác đến 0,001 gam vào bình định mức dung tích 1 lít đã được hiệu chuẩn, định mức đến vạch bằng nước cất, thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1 mg/ml.
Lấy lần lượt 0,4 ml; 0,8 ml; 1,2 ml; 1,6 ml và 2,0 ml dung dịch chuẩn gốc vào các bình định mức 25 ml đã được hiệu chuẩn, thêm 2,0 ml nước cất, tiếp đó thêm 1,5 ml thuốc thử 3,5-DNS vào mỗi bình.
Mỗi hỗn hợp được tạo phản ứng màu bằng cách làm nóng trong bể điều nhiệt ở 100ºC trong 5 phút rồi làm nguội đến nhiệt độ phòng. Định mức đến vạch bằng nước cất, thu được dãy dung dịch chuẩn glucose với nồng độ tương ứng: 16,0 µg/ml; 32,0 µg/ml; 48,0 µg/ml; 64,0 µg/ml; 80,0 µg/ml.
Đo độ hấp thụ quang của dãy dung dịch chuẩn ở bước sóng 550 nm. Ghi lại cường độ hấp thụ của dung dịch glucose tại các nồng độ khác nhau. Vẽ đường cong tiêu chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ glucose (trục Ox) vào cường độ hấp thụ (trục Oy).
b) Chuẩn bị dung dịch thử (dịch chiết glucomannan)
Cân 0,2 gam mẫu thử chứa glucomannan, chính xác đến 0,01 gam vào bình tam giác dung tích 100 ml đã chứa sẵn 50 ml dung dịch đệm HCOOH – NaOH, sau đó đem khuấy và để dung dịch trương nở ở nhiệt độ 30ºC trong 4 giờ hoặc ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Định mức đến 100 ml bằng dung dịch đệm HCOOH – NaOH, rồi ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút ở 25ºC, loại bỏ phần cặn thu được dung dịch thử glucomannan.
c) Thủy phân dung dịch thử glucomannan
Lấy chính xác 5 ml dung dịch thử glucomannan cho vào bình định mức 25 ml đã được hiệu chuẩn. Thêm chính xác 2,5 ml dung dịch H2SO4 3M, khuấy đều dung dịch, sau đó tiến hành thủy phân bằng cách thủy ở nhiệt độ 100ºC trong
thời gian 150 phút. Làm nguội dung dịch đến nhiệt độ phòng, sau đó thêm 2,5 ml dung dịch NaOH 6M, lắc đều rồi định mức đến vạch chuẩn bằng nước cất.
d) Tiến hành đo độ hấp thụ
Dùng pipet lấy lần lượt 2,0 ml dung dịch thử glucomannan, dung dịch thử glucomannan đã được thủy phân cho vào hai bình định mức 25 ml và một bình định mức chứa nước cất. Thêm 1,5 ml dung dịch thuốc thử 3,5-DNS vào mỗi bình, phản ứng màu bằng cách làm nóng trong bể điều nhiệt ở 100ºC trong 5 phút, sau đó làm nguội nhanh đến nhiệt độ phòng, định mức đến vạch chuẩn bằng nước cất.
Dung dịch được đem đo quang ở bước sóng 550 nm bằng máy UV – VIS. Sử dụng mẫu trống là nước cất. Hàm lượng glucose tương ứng với cường độ màu có thể tính toán dựa trên đường chuẩn hoặc theo phương trình hồi quy.
2.2.3.4. Tính toán kết quả
Hàm lượng glucomannan trong mẫu thử được tính theo công thức:
€ 5 – 50 1000 100 F T To M A (2.1) Trong đó:
A: hàm lượng glucomannan trong mẫu thử (%).
€: tỷ lệ giữa khối lượng phần glucose liên kết trong phân tử glucomannan và khối lượng phân tử glucose tạo thành sau thủy phân; € ≈ 0,9.
T: hàm lượng glucose trong dung dịch glucomannan sau khi thủy phân. To: hàm lượng glucose trong dung dịch glucomannan trước khi thủy phân. F: hệ số tương quan giữa nồng độ glucose và nồng độ glucomannan.