5. Dự kiến kết quả đạt được
2.3. Khảo sát sự thích nghi của một số loài thuộc chi Amorphophallus tạ
một số vùng ở Tây Nguyên và lập hồ sơ thu mẫu
Việt Nam có hơn 20 loài thuộc chi Amorphophallus nhưng chỉ có ba loài phổ biến hơn cả, bao gồm Amorphophallus konjac K.Koch (Nưa konjac),
Amorphophallus krausei Engl.&Gehrm (Nưa krausei) và Amorphophallus
yuloensis H.Li (Nưa vân nam). Chúng tôi tiến hành thu thập mẫu củ Nưa tại
một số tỉnh như Hà Giang, Sơn La, Hòa Bình sau đó lựa chọn được ba loài ký hiệu lần lượt là M1, M2 và M3 để gây trồng tại Tây Nguyên. Lập hồ sơ thu mẫu được tiến hành theo các phương pháp dưới đây:
Phƣơng pháp thu thập thông tin
Tập hợp, phân tích và đánh giá các tài liệu khoa học, sách, các tạp chí chuyên ngành có liên quan để xác định cụ thể đối tượng và khu vực điều tra thu thập. Đây là cơ sở để lên kế hoạch cho các chuyến điều tra và thu mẫu ngoài thực địa.
Phƣơng pháp nghiên cứu ngoài thực địa
Điều tra và thu mẫu ngoài thực địa: Trên cơ sở các tài liệu nghiên cứu về
chi Amorphophallus hiện có ở Việt Nam, kết hợp với những khảo cứu sơ bộ,
chúng tôi đã tiến hành chọn các tuyến và địa điểm đại diện để điều tra và thu mẫu phục vụ cho nghiên cứu. Ngoài ra, để có thêm thông tin về đối tượng nghiên cứu, phương pháp điều tra có sự tham gia như đánh giá nông thôn có sự tham gia (PRA-Participatory Rural Appraisal) cũng được sử dụng để thu thập thêm thông tin cũng như thu thập kiến thức bản địa về sử dụng Nưa. Tuyến điều tra thường xuyên qua các môi trường sống của đối tượng thực hiện, nghĩa là các tuyến đó cắt ngang các vùng đại diện cho khu vực nghiên cứu.
Đối với mẫu dùng cho phân loại: mỗi mẫu thu có đầy đủ các bộ phận
như lá (lá non, lá trưởng thành), hoa (chùm hoa) và quả (quả non, quả già có hạt)… kích thước mẫu khoảng từ 35 - 42 cm, được đặt trong các tờ giấy báo. Mỗi một cá thể loài thu từ 4 - 8 mẫu. Các mẫu thu trên cùng một cây thì đánh
dấu cùng một số hiệu mẫu, các mẫu thu cùng loài nhưng khác cây thì đánh dấu khác số hiệu mẫu.
Đối với mẫu dùng cho xác định hàm lượng hoạt chất: thu củ, sau đó tiến
hành xử lý sơ bộ, cho vào túi nilon (có dán nhãn) rồi mang về phòng thí nghiệm để tiếp tục nghiên cứu.
Xử lý mẫu sơ bộ ngoài thực địa: để tránh hư hỏng, các mẫu thu được xử
lý sơ bộ ngoài thực địa.
Phƣơng pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
Xử lý và giám định tên: mẫu sau khi mang về phòng thí nghiệm được sấy
ngay. Trước khi sấy thay giấy báo mới và bó chặt bằng cặp gỗ rồi cho vào tủ sấy. Khi sấy mẫu được dựng đứng để nước bốc hơi dễ dàng và mẫu chóng khô. Để giám định tên thực vật, giá trị làm thuốc, dạng sống, chúng tôi sử dụng một số tài liệu như: Cây cỏ Việt Nam (Phạm Hoàng Hộ, 2000), Thực vật chí Đông Dương (Flore générale de I’ Indo-chine, H, Lecomle), Từ điển cây thuốc Việt Nam của Võ Văn Chi (1997), Cây thuốc và động vật làm thuốc của Viện dược liệu (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam của Đỗ Tất Lợi (2009),...
Phƣơng pháp phân tích đối chiếu
So sánh điều kiện môi trường nơi thu thập mẫu để đánh giá, thành phần loài Nưa phù hợp cho việc trồng thử nghiệm tại Tây Nguyên.
2.4. Xác định hàm lƣợng glucomannan trong một số loài Nƣa thu đƣợc
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát và thu thập được ba mẫu M1:
Amorphophallus konjac K.Koch, M2: Amorphophallus krausei Engl.&Gehrm
và M3: Amorphophallusyuloensis H.Li.
Cách xử lý mẫu:
Tiến hành xử lý mẫu như mục 2.2.3.1.
Xác định hàm lượng glucomannan trong bột Nưa:
2.5. Xác định hàm lượng glucomannan trong một số chế phẩm bột Nưa
Cách chế biến sản phẩm bột Nưa thực hiện theo sơ đồ 2.1 dưới đây:
Sơ đồ 2.1: Qui trình chế biến chế phẩm bột Nƣa
Củ Nưa sau khi được thu hái đem rửa sạch sau đó gọt bỏ vỏ. Thái củ Nưa
thành từng lát mỏng 1 - 2 mm rồi nhúng vào dung dịch NaHSO3 0,2‰, vớt ra
và dùng máy xay nghiền ướt với dung môi etanol:nước (1,5:1). Lọc bỏ dịch, phần còn lại đem ly tâm để thu tủa. Tủa thu được đem sấy lạnh rồi nghiền mịn thu được bột Nưa. Bột Nưa thu được đem nghiền và ly tâm lặp lại 3 lần sẽ thu được bột Nưa kỹ thuật, khi thực hiện nghiền và ly tâm lặp lại 5 lần sẽ thu được bột Nưa tinh chế. Củ Nưa tươi Rửa sạch Gọt vỏ Thái lát mỏng 1 - 2 mm Nhúng vào dung dịch NaHSO3 0,2‰ Nghiền ướt trong 40 phút Bổ sung etanol:nước (1,5:1) Màng lọc + Ly
tâm thu tủa
Sấy lạnh tủa Nghiền mịn
Bột Nƣa Loại bỏ dịch Nghiền 3 lần Bột Nƣa kỹ thuật Nghiền 5 lần Bột Nƣa tinh chế
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả xây dựng qui trình định lƣợng glucomannan trong một số loài thuộc chi Amorphophallus
Chúng tôi đã tiến hành xây dựng qui trình định lượng glucomannan trong một số loài thuộc chi Amorphophallus bằng phương pháp so màu với chất hiện màu 3,5-DNS. Theo tài liệu đã công bố trên thế giới [40] cho thấy phương pháp so màu với chất hiện màu 3,5-DNS được đánh giá là chính xác hơn so với việc sử dụng enzim hoặc phenol-sulfuric axit làm chất hiện màu. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, dễ thao tác và tiết kiệm chi phí hơn so với phương pháp phân tích glucomannan bằng HPLC. Quá trình thực hiện được tiến hành theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ qui trình định lƣợng glucomannan trong một số loài thuộc chi Amorphophallus
Chuẩn bị dung dịch thuốc thử
Dung dịch thuốc thử 3,5-DNS Dung dịch đệm HCOOH – NaOH 0,1 mol/l
Xây dựng đường chuẩn glucose Xác định hệ số tương quan giữa nồng độ
glucose và nồng độ glucomannan Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và
giới hạn định lượng (LOQ) Xác định độ lặp lại và độ thu hồi của
Các bước xây dựng qui trình định lượng glucomannan trong một số loài thuộc chi Amorphophallus:
Bƣớc 1: Chuẩn bị dung dịch thử.
Bƣớc 2: Xây dựng đường chuẩn glucose.
Bƣớc 3: Xác định hệ số tương quan giữa nồng độ glucose và nồng độ glucomannan.
Bƣớc 4: Xác định giới hạn phát hiện (LOD) vàgiới hạn định lượng (LOQ).
Bƣớc 5: Xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp.
3.1.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn glucose
Chuẩn bị các dung dịch glucose chuẩn có nồng độ lần lượt là 16 µg/ml; 32 µg/ml; 48 µg/ml; 64 µg/ml và 80 µg/ml để dựng đường chuẩn bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc như đã nêu ở mục 2.2.3.2.
Các dung dịch chuẩn này được tiến hành đo độ hấp thụ được lựa chọn ở bước sóng 550 nm, vẽ đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ glucose. Kết quả được thể hiện trên hình 3.1.
Hình 3.1: Đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ hấp thụ (A) và nồng độ (µg/ml) của glucose
Kết quả thu được là một đường thẳng y = 0,0074x + 0,0415 đi qua gốc tọa độ biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ glucose có hệ số tương quan R2 = 0,9946. Từ đó cho thấy giữa nồng độ glucose và giá trị độ hấp thụ đo được có sự tương quan tuyến tính tốt trong khoảng nồng độ 16 µg/ml đến 80 µg/ml. Điều này chứng tỏ rằng các giá trị thông số của phương pháp mà chúng tôi đã lựa chọn là phù hợp cho việc phân tích định lượng.
Như vậy, khoảng xác định của đường chuẩn chúng tôi xây dựng là ở nồng độ của glucose từ 16 µg/ml đến 80 µg/ml.
3.1.2. Kết quả xác định hệ số tương quan giữa nồng độ glucose và nồng độ
glucomannan
Để xác định hệ số tương quan F giữa nồng độ glucose và nồng độ glucomannan trong các mẫu bột Nưa nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thí nghiệm lặp lại 10 lần đối với mẫu glucomannan chuẩn.
Tiến hành cân chính xác khoảng 0,2 gam glucomannan chuẩn và chuẩn bị dung dịch thử glucomannan như đã nêu ở mục 2.2.3.2, thủy phân dung dịch đó theo phương pháp đã nêu ở mục 2.2.3.3, sau đó tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng 550 nm đối với dung dịch glucomannan trước và sau thủy phân.
Dựa vào đường chuẩn đã xây dựng được ở mục 3.1.1 để suy ra nồng độ glucose trong dung dịch glucomannan trước và sau khi thủy phân theo công thức (2.1). Từ đó tính được hệ số tương quan F giữa nồng độ glucose và nồng độ glucomannan.
Bảng 3.1: Kết quả xác định hệ số tƣơng quan F STT Khối lƣợng glucomannan chuẩn (g) Nồng độ glucomannan chuẩn (µg/ml) Nồng độ glucose (µg/ml) Hệ số F 1 0,2117 2117 71,62 29,56 2 0,2008 2008 76,82 26,14 3 0,2205 2205 77,14 28,59 4 0,2085 2085 74,74 27,90 5 0,2036 2036 75,69 26,90 6 0,2085 2085 72,45 28,78 7 0,1986 1986 71,10 27,93 8 0,2011 2011 71,65 28,07 9 0,2088 2088 71,42 29,24 10 0,2064 2064 67,32 30,66 TB 28,38
Giá trị F thu được là trung bình cộng của 10 lần lặp lại, bằng kết quả thực nghiệm chúng tôi xác định được giá trị F = 28,38.
3.1.3. Kết quả xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) (LOQ)
3.1.3.1. Khảo sát mẫu trắng
Tiến hành thí nghiệm lặp lại 14 lần đối với mẫu trắng là tinh bột biến tính được xác định là không chứa glucose và không bị thủy phân.
Cân chính xác khoảng 0,2 gam mẫu trắng và chuẩn bị dung dịch trước và sau khi thủy phân với các điều kiện như đã nêu ở mục 2.2.3.2 và 2.2.3.3, sau đó đo độ hấp thụ của các dung dịch ở bước sóng 550 nm.
Các giá trị đo được đều nhận giá trị âm chứng tỏ trong mẫu không chứa glucomannan.
3.1.3.2. Xác nhận LOD, LOQ
Dùng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu trắng: lấy 7,5 ml dung dịch glucomannnan chuẩn nồng độ 2 mg/ml vào bình tam giác dung tích 100 ml đã chứa sẵn 0,2 gam mẫu trắng (tinh bột biến tính) và tiến hành chuẩn bị dung dịch thử như ở mục 2.2.3.2, thủy phân và đo độ hấp thụ như ở mục 2.2.3.3.
Nồng độ của dung dịch glucomannan trước thủy phân là 0,15 mg/ml. Nồng độ glucomannan thực tế trong mẫu thử được tính theo công thức:
C glucomannan = F x C glucose tính toán (3.1) Trong đó:
F: hệ số tương quan; F = 28,38.
C glucose tính toán : nồng độ glucose tính theo đường chuẩn.
C glucomannan : nồng độ glucomannan thực tế trong mẫu thử.
Lặp lại thí nghiệm như trên 6 lần. Kết quả các giá trị nồng độ glucomannan thực tế trong mẫu thử đo được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2: Kết quả xác định giới hạn phát hiện LOD bằng phƣơng pháp thêm chuẩn
Nồng độ glucomannan thực tế trong mẫu thử đo đƣợc (µg/ml) Lần 1 147,00 Lần 2 147,00 Lần 3 147,24 Lần 4 147,36 Lần 5 147,76 Lần 6 147,46 Giá trị trung bình 147,30 SD 0,266
Giá trị giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của glucomannan được xác định bởi các công thức tính sau:
LOD = 3,3 x SD/a (3.2) LOQ = 10 x SD/a (3.3) Trong đó:
SD: độ lệch chuẩn của 6 lần đo lặp lại; SD = 0,266. a: độ dốc của đường cong chuẩn; a ~ 0,0415.
Như vậy đã xác định được:
Giá trị giới hạn phát hiện LOD = 21,15 µg/ml. Giá trị giới hạn định lượng LOQ = 64,10 µg/ml.
3.1.4. Kết quả độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp
Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp là yếu tố quan trọng quyết định đến hiệu quả phân tích và được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn với ba
2 mg/ml vào bình tam giác có dung tích 100 ml đã chứa sẵn 0,2 gam mẫu trắng và tiến hành các bước tương tự như ở mục 2.2.3.2. Kết quả các giá trị nồng độ glucomannan đo được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3: Kết quả đánh giá độ lặp lại bằng phƣơng pháp thêm chuẩn
Mức thêm chuẩn Nồng độ glucomannan đo đƣợc (µg/ml) Mức 1 Mức 2 Mức 3 Lần 1 198,23 514,36 1214,53 Lần 2 197,87 510,12 1208,72 Lần 3 197,95 512,00 1230,14 Lần 4 197,31 515,87 1213,04 Lần 5 198,34 512,90 1215,95 Lần 6 197,21 511,01 1222,44 Giá trị trung bình 197,82 512,71 1217,47 RSD (%) 0,22 0,38 0,57
Kết quả tính toán cho thấy các giá trị độ lệch chuẩn tương đối của nồng độ glucomannan đo được tương ứng của các mẫu trắng thêm chuẩn tại ba mức thêm đều nhỏ hơn 1%. Điều này chứng tỏ các điều kiện xử lý mẫu và phương pháp phân tích đã lựa chọn ổn định, có độ lặp lại cao, phù hợp để xác định hàm lượng glucomannan.
Độ thu hồi của phương pháp tương ứng với ba mức thêm chuẩn được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4: Kết quả đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp định lƣợng glucomannan
Mức 1 Mức 2 Mức 3
Hiệu suất thu hồi trung bình
(%)
Hiệu suất thu hồi glucomannan 98,9 98,6 98,2 98,5
Kết quả độ thu hồi của glucomannan khá cao đạt 98,5%. Vì vậy, có thể kết luận phương pháp phân tích đáng tin cậy.
Như vậy, đây là lần đầu tiên ở Việt Nam chúng tôi đã xây dựng được phương pháp định lượng glucomannan bằng phương pháp so màu với chất hiện màu 3,5-DNS. Phương pháp này được đánh giá là có độ ổn định, độ lặp lại và độ chính xác cao với giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của glucomannan lần lượt là 21,15 µg/ml và 64,10 µg/ml, độ thu hồi trung bình đạt 98,5%. Phương pháp mà chúng tôi đã xây dựng thích hợp để xác định hàm lượng glucomannan có trong nguyên liệu củ Nưa, góp phần định hướng loài Nưa có chất lượng để phục vụ cho việc thu mua nguyên liệu, trồng, sản xuất và chế biến glucomannan trong nước. Ngoài ra, phương pháp này cũng có thể áp dụng để đánh giá hàm lượng glucomannan trong các sản phẩm bột Nưa có trên thị trường nhằm phục vụ các mục đích khác nhau.
3.2. Kết quả khảo sát sự thích ứng một số loài thuộc chi Amorphophallus ở Tây Nguyên Tây Nguyên
Từ kết quả so sánh theo các tính trạng đặc trưng của từng mẫu giống với nhau, so sánh tiêu bản gốc qua hình ảnh, đối chiếu với các tài liệu phân loại học chính thống, kết hợp với phân tích sơ đồ hình cây, bước đầu cho phép chúng tôi lập hồ sơ cho ba mẫu M1, M2 và M3 trong nghiên cứu như sau:
Mẫu số 1:
Giới (Kingdom): Plantae (thực vật)
Ngành: Mangnoliophyta/Tracheophyta (ngọc lan) Lớp: Liliopsida (một lá mầm)
Bộ: Alismatales (trạch tả) Họ - Family: Araceae (ráy)
Chi - Genus: Amorphophallus (củ Nưa)
Loài - Species: Amorphophallus konjac K.Koch.
Như vậy mẫu số M1 được xác định tên khoa học là Amorphophallus
konjac K.Koch.
Mẫu số 2:
Giới (Kingdom): Plantae (thực vật)
Ngành: Mangnoliophyta/Tracheophyta (ngọc lan) Lớp: Liliopsida (một lá mầm)
Bộ: Alismatales (trạch tả) Họ - Family: Araceae (ráy)
Chi - Genus: Amorphophallus (củ Nưa)
Loài - Species: Amorphophallus krausei Engl. & Gehrm.
Như vậy mẫu số M2 được xác định tên khoa học là Amorphophallus
krausei Engl. & Gehrm.
Mẫu số 3 :
Giới (Kingdom): Plantae
Lớp - Class: Liliopsida (một lá mầm) Bộ: Alismatales (trạch tả)
Họ - Family: Araceae (ráy)
Chi - Genus: Amorphophallus (củ Nưa)
Loài - Species: Amorphophallus yuloensis H.Li.
Như vậy mẫu số M3 được xác định tên khoa học là Amorphophallus
yuloensis H.Li.
a) Củ A.konjac K.Koch b) Củ A.yuloensis H.Li
c) Củ A.krausei Engl. & Gehrm
Từ kết quả phân loại ở trên, chúng tôi thu được ba bộ mẫu giống Nưa được chọn lọc tương đối thuần chủng thuộc các loài A.konjac K.Koch,
A.krausei Engl. & Gehrm và loài A.yuloensis H.Li với lượng mẫu lớn để phục
vụ trồng thử nghiệm ở Tây Nguyên.
Địa hình cao nguyên là địa hình đặc trưng của vùng Tây Nguyên rất thuận lợi cho việc trồng một số loài Nưa. Tây Nguyên là vùng chịu ảnh hưởng của khí hậu cận xích đạo; nhiệt độ trung bình năm khoảng 20ºC, nhiệt độ ngày và đêm chênh lệch cao (> 5,5ºC). Khí hậu Tây Nguyên có hai mùa rõ rệt mùa khô và mùa mưa. Mùa khô nóng hạn, thiếu nước trầm trọng, mùa mưa ẩm, độ ẩm 85 - 90% lượng mưa của cả năm. Đất đai được coi là tài nguyên quý giá của vùng, thuận lợi cho phát triển nông lâm nghiệp. Diện tích đất chủ yếu là đất đỏ bazan, tầng phong hoá dày, địa hình lượn sóng nhẹ tạo thành các cao nguyên đất đỏ. Với những điều kiện trên, Tây Nguyên rất thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của chi Amorphophallus có nguồn gốc từ những vùng có điều kiện