Nồng độ BKV-DNA xác định bằng kỹ thuật real-time PCR với trình tự đặc hiệu cao của BKV được khuếch đại bằng một đầu dò huỳnh quang và số lượng bản sao khuếch đại được so sánh với đường cong chuẩn được tạo ra với các pha loãng nối tiếp của một nồng độ BKV- DNA đã biết. Hầu hết, các phòng thí nghiệm tự phát triển các xét nghiệm của mình nên đã có sự khác biệt đáng kể về kết quảđịnh lượng và ngưỡng phát hiện. Đồng thời, sự khác biệt về nguồn mẫu, quy trình tách chiết DNA, trình tự primer, probe và chủng BKV được sử dụng cho việc thiết lập đường chuẩn có thểảnh hưởng đến kết quảđịnh lượng và dẫn đến sự khó khăn khi đưa ra các quyết định khi can thiệp điều trị trên lâm sàng. Hầu hết các xét nghiệm real-time PCR định lượng sử dụng chủng BKV kiểu gen I (Dunlop) như là trình tự tham chiếu để thiết kế mồi và probe [4].
Năm 2008, Hoffmann và cộng sựđã so sánh các kết quả từ 7 kit thương mại khác nhau sử dụng chủng Dunlop hoặc mẫu lâm sàng (the mixed patient standard, MPS) làm mẫu tham chiếu, kết quả xét nghiệm cho thấy có hiện tượng không nhất quán (khác biệt > 1 log) được xác định trong 23% các xét nghiệm sử dụng MPS và 94% các xét nghiệm sử dụng Dunlop làm mẫu tham chiếu. Hiện tượng này được phát hiện rõ nhất ở kiểu gen III và IV, do sự không phù hợp primer, probe cũng như sự đa hình trình tự BKV-DNA [71]. Một công trình khác đã khẳng định rằng các thử nghiệm PCR của BKV bằng cách sử dụng kiểu gen I như là mẫu tham chiếu có thể ít nhạy hơn với các dòng biến thể (ngưỡng phát hiện 104 copy/μl đối với biến thể so với 10 copy/μl cho kiểu gen I). Đây là một vấn đề cần lưu ý vì các biến thể phụ hiếm gặp của BKV có liên quan đến BKVN [69], có lẽdo khó khăn trong việc phát hiện chúng với tải lượng virus thấp. Để khắc phục hạn chế này, các xét nghiệm nên được thống nhất thực hiện ở một phòng thí nghiệm phù hợp, đủ tiêu chuẩn để theo dõi cho một bệnh nhân, trong trường hợp có nghi ngờ với các biến thể hiếm gặp trong quá trình theo dõi điều trị, biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân không tương quan với tải lượng virus, cần thực hiện các xét nghiệm phân tích sâu hơn về kiểu gen [71]. Do các lựa chọn trong điều trị BKVN hiện nay còn hạn chế nên mục tiêu sàng lọc BKV theo quy trình giúp chẩn đoán sớm bệnh nhân khi có virus nước tiểu hoặc virus máu và can thiệp điều trị phù hợp trước khi phát triển thành BKVN.
Nghiên cứu tại Nhật Bản về phát triển kỹ thuật real-time PCR cho định lượng BKV đã được Iwaki KK và cộng sự công bố năm 2010. Nghiên cứu hướng tới phân tích các điểm đa hình trên một vùng trình tự bảo tồn của BKV (vùng VP2) ảnh hưởng đến xét nghiệm phân tích định lượng BKV. Sử dụng kết hợp các kỹ thuật phân tích, bao gồm phân tích biến đổi trình tự nucleotide trong các chủng của BKV, phân tích và so sánh trình tự axit amin trong vùng gen đích ở các thành viên của họ Polyomaviridae, dựa vào đó thiết kế mồi và probe cho xét nghiệm PCR và phát triển real-time PCR đối với vùng gen đích VP2 của BKV. Kết quả đánh giá sơ bộ cho thấy, thử nghiệm BKV có dải nồng độ rộng 6log với giới hạn phát hiện thấp nhất là 1,5 x 101 copy/phản ứng và độ chính xác cao với hệ số biến thiên nội phản
ứng thấp (CV<5%). Ngoài ra kỹ thuật cũng đưa ra độ nhạy và độ đặc hiệu cao đối với BKV. Công bố này rất có giá trị trong việc đánh giá tác động của các biến thể trình tự vùng VP2, đồng thời cung cấp nguồn dữ liệu phân tử BKV cho các nghiên cứu về dịch tễ học [45].
Nghiên cứu gần đây tại Mỹ(2016) đã so sánh sự khác biệt về nồng độ BKV- DNA khi thiết kế mồi, probe dựa trên trình tự hai vùng gen là VP1 và LTA. Sau khi phân tích hồi quy probit trên những dải nồng độ pha loãng khác nhau cho thấy giới hạn phát hiện của kỹ thuật real-time PCR dựa trên trình tự gen VP1 và LTA lần lượt là 1,8 x 102 copy/ml và 3,5 x 102 copy/ml với độ tin cậy 95%. Phân tích độ nhạy và độ đặc hiệu trên 116 mẫu bệnh phẩm lâm sàng, xác định được độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật real-time PCR dựa trên trình tự gen VP1 và LTA lần lượt là 90%, 96% và 97%, 98% [40].