Kiểu gen BKV có thểđược xác định thông qua phương pháp huyết thanh học và sinh học phân tử. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của lĩnh vực sinh học phân tử, việc xác định kiểu gen BKV có thể được thực hiện thông qua các phương pháp như PCR hoặc real-time PCR đa mồi, RFLP… Tuy nhiên, giải trình tự và xây dựng cây chủng loại phát sinh là phương pháp tối ưu nhất với độ tin cậy, độ chính xác cao, đồng thời cho phép phân tích những đột biến SNP (Single Nucleotide Polymorphism) làm thay đổi độc lực của virus.
Việc lựa chọn gen đích và phương pháp xây dựng cây chủng loại phù hợp để xác định kiểu gen là vấn đề mấu chốt giúp cây chủng loại phát sinh có độ tin cậy cao. Nghiên cứu của Zhang-Yang Wang và cộng sự (2015) [87] trên 23 mẫu huyết tương và 95 mẫu nước tiểu dương tính với BKV dựa trên trình tự vùng gen VP2 và hai phương pháp phân tích UPGMA, Neighbour Joining cho độ tin cậy không cao khi giá trị bootstraps lần lượt là 25%-61% và 0%-17%. Trong quá trình phân tích phát sinh dựa trên trình tự gen VP2, nghiên cứu này cho thấy phương pháp NJ không thể tạo ra một cây phát sinh gen phù hợp và chỉ ra rằng phương pháp UPMGA tốt hơn cho kiểu gen. Mặt khác, đa hình cũng xuất hiện nhiều ở gen kháng nguyên T lớn, chiếm 11,39% trong tất cả các vị trí nucleotide. Các locus đa hình BKV cũng đã được phát hiện khi so sánh các vùng kiểm soát không mã hóa (NCCR). Nghiên cứu của Luo C và cộng sự cho thấy cây phát sinh gen dựa trên kháng nguyên T lớn (LTA) cho phép tách kiểu gen I thành các phân nhóm I/a, I/b-1, I/b-2 và I/c, với giá trị bootstrap là 100%, tốt hơn so với bootstraps thu được khi sử
dụng chuỗi VP1 (giá trị bootstrap từ 71% đến 97%). Tuy nhiên, sự phân chia của các phân nhóm IV cho giá trị bootstraps không cao (33%) [58].
Do bộ gen của BKV có rất nhiều vị trí đột biến, đặc biệt khu vực mã hóa đa hình nhiều nhất trong bộ gen virus là VP1 nên các nghiên cứu phần lớn đều tập trung vào tính đa hình của gen VP1 cũng như các đột biến trong dư lượng axit amin được mã hóa bởi gen VP1. Hơn nữa, hầu hết các nghiên cứu trước đây xác định 4 kiểu gen BKV dựa vào trình tự toàn bộ gen hoặc trình tự vùng gen VP1 với công bố đầu tiên của Jin và cộng sự (1993) [47]. Khi xây dựng cây chủng loại phát sinh dựa trên trình tự gen VP1, phương pháp NJ thường được áp dụng cho gen VP1 do tính đa dạng đa hình cao [15]. Đáng chú ý là kiểu gen dựa trên gen VP1 mang lại định nghĩa rõ ràng hơn về các phân nhóm khi phân tích các đoạn gen ngắn hơn 300 bp [46]. Điều này chỉ ra rằng VP1 mang nhiều thông tin hơn. Nghiên cứu của Boukoum H và cộng sự (2016) [16] trên 72 bệnh nhân ghép thận tại Tunisia dựa trên đoạn trình tự 287 bp (1650-1936, chủng Dunlop-V01108) gen VP1 theo phương pháp xây dựng cây chủng loại phát sinh NJ cho thấy giá trị bootrap chính đều lớn hơn 60%. Tương tự, những nghiên cứu khác [44],[56] cũng đều chỉ ra việc xác định kiểu gen BKV bằng việc phân tích đoạn trình tự 287 bp trên vùng lặp BC thuộc gen VP1 cho độ tin cậy, độ chính xác cao. Do đó, kiểu gen BKV trên những bệnh nhân ghép thận tại Việt Nam xác định trong nghiên cứu này dựa trên vùng gen VP1 (1630-1956) và phương pháp NJ.
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU