• Tạo đoạn chèn bằng PCR
Để tạo đoạn chèn vùng gen VP1 gắn vào vector tách dòng, BKV-DNA sau khi tách bằng Exgen SV-mini blood kit (GeneAll) được khuếch đại bằng cặp mồi đặc hiệu BKS/BKAS. Kết quảPCR được thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3. 1. Khuếch đại đoạn chèn cho tách dòng
Chú thích: 1. Marker 100 bp (Thermo Fisher, USA), 2. Đối chứng âm (nước thay cho DNA), 3-4. Mẫu dương tính với BKV.
Từ kết quảđiện di cho thấy, băngđặc hiệu có kích thước là 580 bp, đậm nét và không có sản phẩm phụ (giếng 3-4). Đối chứng âm không lên băng (giếng 2) chứng tỏ thao tác kỹ thuật tốt, đáng tin cậy. Trong nghiên cứu này, Phusion Hight- Fidelity PCR master mix 2X được sử dụng gồm hỗn hợp chứa Phusion DNA Polymerase, các nucleotide, buffer và MgCl2. Phusion DNA polymerase có hai hoạt tính: 5’-3’ DNA polymerase và 3’-5’ exonuclease. Tỷ lệ lỗi của Phusion DNA
polymerase trong buffer HF là 4,4 x10-7, thấp hơn 50 lần so với Taq DNA polymerase, thấp hơn 6 lần so với Pfu DNA polymerase. Phusion DNA polymerase đạt được hiệu suất cao trong thời gian ngắn ngay cả khi có mặt của các chất ức chế phản ứng PCR, do đó tạo ra năng suất cao hơn với lượng enzyme thấp hơn các DNA polymerase khác. Như vậy, Phusion DNA polymerase là sự lựa chọn tốt nhất cho tách dòng.
Chu trình nhiệt phản ứng PCR với sự có mặt của Phusion DNA polymerase có nhiều khác biệt so với các điều kiện chuẩn của DNA polymerase khác. Nhiệt độ biến tính là 98oC (cao hơn nhiệt độ biến tính của enzyme thông thường là 95oC), cho phép cải thiện khảnăng phân tách DNA ngay cả với khuôn dài và giàu GC, thời gian ngắn (biến tính (5 giây- 10 giây); kéo dài (15 giây- 30 giây); gắn mồi (10 giây- 30 giây)) giúp tiết kiệm thời gian nhưng hiệu quả PCR vẫn không thay đổi.
• Biến nạp
Sau khi biến nạp, tế bào E. coli DH5α được nuôi lỏng trên môi trường dinh dưỡng (SOC) trong 2 giờ 30 phút, lắc 225 vòng/phút, 37oC và được cấy trải trên môi trường LB-ampicilin (50 µg/µl)/IPTG/Xgal. Sau 24 giờ, xuất hiện các khuẩn lạc trắng (chứa plamid tái tổ hợp) và khuẩn lạc xanh (chỉ chứa plasmid) trên đĩa thạch (Hình 3.2).
Hình 3. 2. Kết quả sàng lọc plasmid tái tổ hợp trên môi trường
LB đặc/IPTG/Xgal
Khuẩn lạc xanh
• Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn EcoRI, AvaII và giải trình tự
Để xác định chính xác khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp, tiến hành nuôi riêng rẽ các khuẩn trắng trong 5ml LB-ampicilin (100 µg/µl), 24 giờ, lắc 225 vòng/phút, 37oC, tách plasmid và kiểm tra bằng AvaII và EcoRI. Kết quả kiểm tra bằng enzyme giới hạn được thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3. 3. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI và AvaII
Chú thích: 1. Plasmid tái tổ hợp được cắt bằng enzyme EcoRI, 2. Marker 1kb (Thermo Fisher, USA), 3. Marker 100 bp (Thermo Fisher, USA), 4. Plasmid tái tổ hợp được cắt bằng enzyme AvaII.
Plasmid tái tổ hợp có kích thước là 3595 bp. Enzyme EcoRI có ba vị trí trên plasmid tái tổ hợp (một điểm nằm bên trong đoạn chèn VP1, hai điểm nằm trên vector pGEM-T easy). Như vậy, nếu plasmid tái tổ hợp được cắt bằng EcoRI sẽ cho ba băng có kích thước lần lượt là 222bp, 376bp và 2997bp. Plasmid tái tổ hợp tiếp tục được kiểm tra bằng enzyme AvaII. Do có bốn vị trí cắt trên plasmid tái tổ hợp (hai điểm nằm bên trong đoạn chèn VP1, 2 điểm nằm trên vector pGEM-T easy) nên sẽ cho 4 băng có kích thước lần lượt là 45bp, 222bp, 1529bp và 1839bp (Hình
3.3). Từ kết quảđiện di kiểm tra sản phẩm cắt bằng hai enzyme cho thấy những sản phẩm thu được đúng như trong tính toán lý thuyết, do đó khả năng plasmid chứa đoạn chèn VP1 rất cao.
Sau đó, plasmid tái tổ hợp tiếp tục được giải trình tự theo nguyên lý Sanger (máy ABI 3730XL) trên cả 2 chiều sử dụng mồi của vector. So sánh trình tự thu được với các trình tự trên Ngân hàng gen quốc tế bằng phần mềm Blast đã khẳng định plasmid chứa đoạn gen VP1-BKV với độ tin cậy 99% (Hình 3.4).
Hình 3. 4. Kết quả so sánh trình tựđoạn chèn với trình tự trên Ngân hàng gen Quốc tế bằng phần mềm Blast