Các khu vực đa hình gen dẫn tới các kiểu đột biến khác nhau ở những vị trí địa lý khác nhau. Phân tích cây chủng loại phát sinh cho thấy, BKV lưu hành tại Việt Nam chỉ thuộc kiểu gen I và kiểu gen IV, do đó dựa vào đoạn trình tự 327 bp, tương ứng với trình tự nucleotide ở vị trí 1630-1956 được phân tích để xác định sự khác biệt giữa BKV-I và BKV-IV. Kết quả phân tích từ 26 trình tự tham chiếu và 40 trình tự chứa đoạn gen VP1 phân lập tại Việt Nam có kích thước 327 bp (1630 - 1956) được thể hiện ở bảng 3.9.
Bảng 3. 9. Vị trí SNP khác nhau giữa kiểu gen BKV-I và BKV-IV Vị trí SNP Vị trí aa BKV-I BKV-IV Thay đổi aa
1704 47 G A 1716 51 C T 1722 53 C T 1744 61 G A E=>N/S 1746 61 A T 1747 62 A G N=>D 1760 66 T A E=>Y 1769 69 A G K=>R 1770 69 G A 1775 71 G C S=>T 1784 74 A C N=>T 1787 75 A C 1792 77 A G S=>D/N/E/Q/H 1793 77 G A 1809 82 G/A C E=>D 1848 95 C A 1851 96 C A/G 1854 97 C T 1869 102 C T 1890 109 G A 1912 117 C A Q=>K 1938 125 C T
Sau khi so sánh, 22 vị trí SNP khác nhau giữa kiểu gen I và IV đã được phát hiện (bảng 3.9). Trong số đó, 10 SNP làm thay đổi trình tự axit amin capsid của BKV (1746, 1747, 1760, 1769, 1775, 1784, 1792, 1793, 1809, 1912). Nghiên cứu của Preety M. Sharma và cộng sự (2006) [4] ở tiểu bang Pennsylvania, Hoa Kỳ phát hiện 10 vị trí SNP khác nhau giữa BKV-I và BKV-IV từ vị trí 1630-1956, trong đó 9/10 SNP (1704, 1722, 1747, 1760, 1769, 1770, 1784, 1851, 1854) trùng với SNP trong nghiên cứu này. Vị trí SNP khác biệt duy nhất ở vị trí 1912, khi có sựthay đổi nucleotide C=>A (BKV-I => BKV-IV), trong khi đó ở nghiên cứu của Preety M. Sharma không có sự khác biệt ở vị trí nucleotide 1912 giữa BKV-I và BKV-IV. Tuy nhiên, trong nghiên cứu Luo C và cộng sự (2008) [58], có sự thay đổi nucleotide 1912 từ C=>A giữa hai kiểu gen I và IV. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng đồng nhất với các kết quả nghiên cứu khác trên thế giới [62].
25 mẫu BKV-I tiếp tục được so sánh với chủng Dunlop và các chủng quốc tế thuộc phân nhóm I trong vùng gen VP1 (1630-1956) để xác định vị trí đa hình. Kết quả so sánh được thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3. 10. Xác định vị trí SNP BKV-I trong vùng gen VP1 (1630-1956) SNP Dunlop (I/a) AB211369 (I/b-1) AB211370 (I/b-2) AB211372 (I/c) Mẫu NC Tần số 1698 T A A A A 25/25 1786 G G G G A/G 5/25, 20/25 1809 G A A G A 25/25 1923 T C C T C 25/25 1929 A A A A A/G 24/25, 1/25 Kết quả phân tích cho thấy 5 vị trí khác biệt giữa phân nhóm I/b-1 (Việt Nam) so với chủng Dunlop (bảng 3.10), với 3/5 vị trí khác biệt (1698, 1809, 1923) tương đồng với chủng tham chiếu I/b-1. Các phân nhóm I có trình tự khá bảo thủ,
trong đó phân nhóm I/b-1 Việt Nam tương đồng khoảng 98,5% so với chủng Dunlop, không có sự khác biệt SNP đặc trưng BKV-I trong vùng gen VP1 (1630- 1956) để phân biệt các phân nhóm với nhau. Tuy nhiên, ở vị trí 1786 (tương ứng với axit amin 75) trên một số chủng Việt Nam, xuất hiện vị trí SNP (G=>A), làm thay đổi axit amin Asp=>Asn, với tần số 5/25 mẫu (20%). Đây là vị trí SNP hiếm, không nằm trong phạm vi SNP mà Jin và cộng sự đã mô tả năm 1993 nhằm phân biệt các kiểu gen BKV [47], nhưng đã được Tremolada S và cộng sự (2010) ghi nhận là kiểu đột biến hiếm và thường xuất hiện trong nước tiểu ở những bệnh nhân BKVN [84].
Từ kết quả cây chủng loại phát sinh, 15 trình tự BKV-IV đều thuộc ba phân nhóm IV/a-1, IV/a-2, IV/c-1. Do đó,để khảo sát sự đa dạng trình tự nucleotide trong phân nhóm IV, 15 trình tự BKV-IV trong nghiên cứu này tiếp tục được so sánh với các phân nhóm IV/a-1 (AB269869), IV/a-2 (AB211389), IV/c-1(AB269867) quốc tế. Kết quảđược thể hiện ở bảng 3.11 và 3.12.
Bảng 3. 11. Đa dạng SNP ở kiểu gen BKV-IV
SNP IV IV/a-1 IV/a-2 IV/c-1 Mẫu NC Tần số
1726 G G G G G/C 14/15,1/15 1735 G G G G G/A 14/15,1/15 1737 T T T T T/C 11/5, 4/15 1741 G G G G G/C 14/15, 1/15 1745 A A A A A/G 2/15, 13/15 1766 T T T T T/A 14/15, 1/15 1769 G G G G G/A 12/15, 3/15 1778 C C C C C/T 14/15, 1/15 1780/1781 GA GA GA GA GA/TC 14/15, 1/15 1792 G G G G G/A/C 10/15, 2/15, 3/15 1794 G G C C C/G/A 10/15, 4/15, 1/15 1851 A A A A A/G 11/15, 4/15 1860 G G A G A/G 10/15, 5/15 1905 G G G A A/G 9/15, 6/15 1938 C T T T T 15/15 1954 G G G G T/G 1/15, 14/15
Bảng 3. 12. Trình tự axit amin ở những vị trí SNP trong phân nhóm IV SNP Vị trí axit amin Dunlop aa IV aa NC aa 1726 55 E P Q 1735 58 D D N 1737 58 D D 1741 60 D D H 1745 61 E N S 1766 68 L L Q 1769/1770 69 K R K 1778 72 A A V 1780/1781 73 E S E 1792 77 S E D, E, Q, H, N 1794 77 S E 1851 96 D A A 1860 99 D D D 1905 114 R R R 1938 125 T T T 1954 131 M M M
Khác với phân nhóm I có sự tương đồng khá cao trình tự nucleotide, phân nhóm IV thể hiện sựđa dạng các vị trí SNP hơn khi so sánh với chủng gốc (trình tự IV, Z19535, Jin L (1993) [47], phân lập tại Anh). Sau khi phân tích, 17 vị trí SNP khác biệt giữa chủng gốc IV và các chủng phân lập tại Việt Nam được quan sát, trong đó nhiều SNP làm thay đổi axit amin. Tuy nhiên, hầu hết các vị trí SNP này xuất hiện đơn lẻ (8/17 vị trí) nhưng đều làm thay đổi trình tự axit amin. Ở vị trí 1737 và 1769 xuất hiện những vị trí SNP với tần suất khá cao trên các chủng Việt Nam, nhưng không xuất hiện trên những phân nhóm IV khác như: 1737 (T=>C) 26,67% dẫn tới sựthay đổi axit amin D=>N, 1769 (G=>A) 20% và thay đổi R=>K. Mặt khác, ở vị trí 1851, xuất hiện đa hình A (73,33%) và G (26,67%), trong đó đa
hình A xuất hiện tại tất cả trình tự tham chiếu thuộc nhóm IV (AB269869, AB269868, AB269858, AB211389, AB269867) còn đa hình G chủ yếu xuất hiện ở kiểu gen BKV-II, BKV-III. Tuy nhiên, đa hình G cũng xuất hiện trong trình tự tham chiếu AB269859 thuộc phân nhóm IV/a-1, phân lập tại Philippine nhưng vị trí đa hình này không làm thay đổi trình tự axit amin. Đặc biệt ở vị trí 1745, trên các chủng Việt Nam xuất hiện vị trí SNP (A=>G) với tần suất 13/15 mẫu (86,67%), dẫn tới sựthay đổi axit amin N=>S. Đây là vị trí SNP đặc biệt để phát hiện kiểu gen IV tại Việt Nam, đại diện cho sự tiến hóa và đột biến theo phương thức riêng và không được tìm thấy ở bất kỳ chủng quốc tế khác.
• Phân tích SNP ở những bệnh nhân BKVN trong mẫu máu và nước tiểu
Chúng tôi tiến hành phân tích trình tự BKV sau khi phân lập theo cặp từ mẫu máu và nước tiểu của 8 bệnh nhân bị BKVN. Kết quả phân tích được thể hiện ở bảng 3.13.
Bảng 3. 13. So sánh trình BKV phân lập theo cặp từ mẫu máu
và nước tiểu của 8 bệnh nhân BKVN STT Loại mẫu KH mẫu Kiểu gen
Sự thay thế axit amin (so với chủng Dunlop) Giới tính 1 Máu 45P IV/c-1 D60H, E61S, N62D, F66Y, K69R, S71T, N74T, D75A, S77D, E82D, Q117K. Nam
Nước tiểu 58UF IV/c-1 E61S, N62D, F66Y, K69R, S71T,
N74T, D75A, S77D, E82D, Q117K.
2
Máu 124PF IV/c-1 E61S, N62D, F66Y, K69R, S71T,
N74T, D75A, S77D, E82D, Q117K.
Nam
Nước tiểu 124UF IV/c-1 E61S, N62D, F66Y, K69R, S71T,
STT Loại mẫu KH mẫu Kiểu gen
Sự thay thế axit amin (so với chủng Dunlop)
Giới tính
3
Máu 152PF IV/c-1 E61S, N62D, F66Y, K69R, S71T,
N74T, D75A, S77D, E82D, Q117K.
Nữ
Nước tiểu 152UF IV/c-1 E61S, N62D, F66Y, K69R, S71T,
N74T, D75A, S77D, E82D, Q117K.
4
Máu 8P I/b-1 D75N
Nữ
Nước tiểu 8U IV/c-1 E61S, N62D, F66Y, K69R, S71T,
N74T, D75A, S77D, E82D, Q117K.
5 Máu 33P I/b-1 D75N Nam
Nước tiểu CM10U I/b-1
6 Máu CM11P I/b-1 D75N Nam Nước tiểu BKV2 I/b-1 7 Máu 145P I/b-1 Nữ
Nước tiểu 145U I/b-1
8
Máu 14P I/b-1 D75N
Nam
Nước tiểu 14U I/b-1 D75N
Trong 8 bệnh nhân BKVN, 7/8 trường hợp (87,5%) có kiểu gen BKV đồng nhất trong máu và nước tiểu, 1 trường hợp (12,5%) bất đồng kiểu gen khi kiểu gen BKV trong máu là I/b-1, trong nước tiểu là IV/c-1. Những nghiên cứu đầu tiên phát hiện đồng nhiễm hai kiểu gen ở cùng một bệnh nhân được công bố vào năm 1995 khi Jin và cộng sự quan sát thấy những trường hợp nhiễm kiểu gen hỗn hợp, đặc trưng bởi sự hiện diện của kiểu gen I và các kiểu gen khác trong mẫu nước tiểu của bệnh nhân nhiễm HIV, trẻ em và phụ nữ có thai [48]. Những nghiên cứu khác trong giai đoạn tiếp theo cũng ghi nhận các trường hợp có sự khác biệt về các phân nhóm
phụ trong mẫu nước tiểu của bệnh nhân ghép thận và người khỏe mạnh [59]. Sự bất đồng kiểu gen BKV giữa máu và nước tiểu cũng được chỉ ra trong nghiên cứu của Ledesma J và cộng sự (2013) [56] khi phân tích vùng gen VP1 của 7 bệnh nhân ghép thận với sự phối kết hợp ngẫu nhiên của cả 4 kiểu gen (I/III, II/III, IV/II, II/I), thậm chí là sự khác biệt phân nhóm trong cùng một kiểu gen (I/b-1, I/b-2). Nhiều giả thuyết cho sự khác biệt kiểu gen BKV trong máu và nước tiểu của bệnh nhân ghép thận đã được công bố, trong đó nguyên nhân đến từngười cho có nguy cơ cao dẫn tới tình trạng trên. Nghiên cứu của Schwarz. A và cộng sự chỉ ra rằng lây truyền virus có nguồn gốc từ người cho là một yếu tố nguy cơ chủ yếu đối với sự phát triển BKV sau ghép hơn là sự tái kích hoạt virus tiềm ẩn từ người nhận. Tình trạng huyết thanh học của người cho được khẳng định là dương tính với BKV nếu người nhận phát hiện bị nhiễm BKV sau khi ghép, và sự nhân lên của virus trong nước tiểu có liên quan đến tình trạng nhiễm virus trong máu của người nhận sau ghép. BKV có thể tương ứng giữa người cho và người nhận hoặc có thể thay đổi trong quá trình lây nhiễm của người nhận đã được mô tảtrước đây [74].
Hầu hết các virus trong phân nhóm I/b-1 không khác so với chủng tham chiếu Dunlop nhưng các biến thểvirus đã được tìm thấy trong số các virus có trong phân nhóm I/b-1 được đặc trưng bởi sự thay thế D75N. Trong số 5 bệnh nhân thuộc phân nhóm I/b-1, sự thay thế D75N chỉ xuất hiện trong máu (3/5 bệnh nhân), cả máu và nước tiểu (1/5 bệnh nhân), không xuất hiện (1/5 bệnh nhân). Sự thay thế D75N chiếm ưu thếhơn trong máu có thể được giải thích do sự khác biệt bởi áp lực chọn lọc trong máu so với các tế bào biểu mô thận ở bệnh nhân dẫn đến sựđa dạng di truyền. Trong số 5 bệnh nhân có BKV-I xuất hiện sự thay thế nucleotide 1786 (D75N, Bảng 3.10), 4/5 trường hợp mắc BKVN. Hiện tượng thay thế D75N thường xuất hiện nhiều hơn ở bệnh nhân BKVN cũng được chỉ ra trong nghiên cứu của Tremolada S và cộng sự (2010) [84]. Khác với kiểu gen I, các phân nhóm IV thể hiện sự đa dạng SNP hơn khi so sánh với chủng tham chiếu Dunlop và được đặc trưng bởi 10 sự thay thế (E61S, N62D, F66Y, K69R, S71T, N74T, D75A, S77D, E82D, Q117K) ở tất cảcác trường hợp. Sự thay thế này xuất hiện đồng nhất ở trong
máu và nước tiểu ở cả3 trường hợp có kiểu gen BKV-IV. Cũng giống như D75N, sự thay thế tại vịtrí K69R cũng được ghi nhận ở những trường hợp mắc BKVN, tuy nhiên biến thể K69R có tốc độ sao chép nhanh hơn so với D75N [84]. Phân tích theo cặp phát hiện 1 vị trí thay thế D60H xuất hiện trong máu nhưng không xuất hiện trong nước tiểu ở bệnh nhân số 1.
3.3.3. Đánh giá vai trò của kiểu gen BKV với bệnh thận do BKV
Từ kết quả cây chủng loại phát sinh cho thấy kiểu gen BKV lưu hành tại Việt Nam gồm BKV-I và BKV-IV. Kết quả phân tích sự phân bố và sự khác biệt giữa các kiểu gen BKV liên quan đến tuổi, giới, các chỉ số xét nghiệm và tình trạng BKVN được trình bày ở bảng 3.14.
Bảng 3. 14. Sự phân bố kiểu gen BKV theo các chỉ số lâm sàng và cận lâm sàng Kiểu gen Thông số BKV-I (n=25) BKV-IV (n=15) p Độ tuổi 41,12 ± 10,94 38,94 ± 8,49 0,50 Giới tính Nữ 6 (14,63%) 4 (9,76%) 1 Nam 19 (46,34%) 12 (29,27%) Creatinin T1 (µmol/ml) 126,16 ± 33,86 134,06 ± 39,62 0,50
Nồng độ BKV-DNA trong máu (log IU/ml) 4,39 ± 1,65 4,57 ± 1,63 0,76 Nồng độ BKV-DNA nước tiểu (log IU/ml) 7,21 ± 2,66 8,25 ± 2,87 0,26 BKVN 5/25 (20%) 3/15 (20%) 1
Từ bảng 3.14 cho thấy không có sự khác biệt giữa các kiểu gen BKV liên quan đến tuổi, giới, các chỉ số xét nghiệm và tình trạng BKVN (p>0,05).
Bệnh thận do BKV là một vấn đề thách thức lâm sàng ở bệnh nhân sau ghép thận khi mà các lựa chọn trong điều trị còn hạn chế, phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm của bác sĩ. Việc theo dõi điều trị bệnh nhân sau ghép thận đóng vai trò rất quan trọng trong duy trì chức năng thận ghép, giảm thiểu tối đa nguy cơ mất mô ghép hay suy chức năng thận ghép. Trong nghiên cứu này, khi phân tích kiểu gen BKV của 8 bệnh nhân BKVN được khẳng định bằng sinh thiết thận, 5/8 (62,5%) thuộc nhóm I/b-1; 3/8 (37,5%) thuộc nhóm IV/c-1, và sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Nghiên cứu của của Boukoum H và cộng sự (2016) trên 34 mẫu bệnh phẩm (máu hoặc nước tiểu) của bệnh nhân ghép thận tại Tunisia cho thấy BKV-I có tỷ lệlưu hành cao nhất (79,5%), trong đó phân nhóm I/b-2 chiếm ưu thế (76,5%). Boukoum H và cộng sựcũngđưa ra nhận định không có sự liên quan giữa kiểu gen và tình trạng BKVN (p>0,05), mặc dù cả hai bệnh nhân bị BKVN đều thuộc phân nhóm I/b-2 [16]. Trong khi đó, nghiên cứu của Pastrana và cộng sự. (2013) [67] chỉ ra rằng BKV -IV chiếm tỷ lệ cao hơn ở bệnh nhân bị BKVN sau ghép thận so với bệnh nhân sau ghép chỉ có BKV dương tính trong máu và nước tiểu. Một số nghiên cứu khác cũng chỉ ra mối liên hệ giữa kiểu gen BKV-II, III, IV với nguy cơ bị BKVN cao hơn ở bệnh nhân ghép thận [61], [83]. Nghiên cứu gần đây của Johannes Korth và cộng sự (2018) [52], cho thấy BKV-I chiếm tỷ lệ cao với 82%, tiếp theo là BKV-IV (14%) và cuối cùng là BKV-II (4%). Điểm đáng chú ý là bệnh nhân BKVN do BKV-II và IV được phát hiện với tỷ lệ cao hơn so với bệnh nhân bị BKVN do BKV-I ((8/10 (80%) so với 17/46 (37%); p = 0,001). Trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ ra BKV-I xuất hiện ở nhóm bệnh nhân BKVN cao hơn (5/8 bệnh nhân) có thể do BKV-I sao chép hiệu quảhơn BKV-IV trong tế bào biểu mô thận cũngnhư BKV-I chiếm ưu thế trong dân số Việt Nam [65].
KẾT LUẬN
1. Xây dựng thành công quy trình định lượng BKV-DNA bằng phương pháp real- time PCR ứng dụng trong kiểm nghiệm xét nghiệm acid nucleic của BKV tại Việt Nam.
+ Hiệu chỉnh thành công bộ mẫu chuẩn nghiên cứu với bộ mẫu chuẩn của WHO: 1 IU = 9,6 copy.
+ Ngưỡng phát hiện 135 IU/ml, độđặc hiệu (100%) và độ ổn định cao.
+ Ngưỡng dựđoán phát triển BKVN ở bệnh nhân ghép thận: trong máu với giá trị 4,12 log10 (IU/ml), độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 95,56%. Trong nước tiểu xác định giá trị ngưỡng BKV-DNA là 6,95 log10 (IU/ml), độ nhạy 87,5%, độ đặc hiệu 84,21%.
2. Phân tích một số đặc điểm di truyền phân tử của BKV ở vùng gen VP1 (1630- 1956) trên những bệnh nhân ghép thận tại Việt Nam.
+ Tỷ lệlưu hành BKV là 64,12%.
+ Phân tích kiểu gen BKV trên 40 mẫu dương tính: BKV-I chiếm 62,5%,