Để xác định nồng độ các thành phần tham gia vào quá trình PCR nhằm đạt được hiệu quả khuếch đại tốt nhất, chúng tôi tiến hành tối ưu nồng độ mồi và nồng độ probe. Kết quả tối ưu nồng đô mồi, probe được thể hiện ở hình 3.6 và 3.7.
Hình 3. 6. Tối ưu nồng độ probe
Nồng độ probe được khảo sát ở các mức 0,05 µM; 0,1 µM ; 0,15 µM; 0,2 µM; 0,3 µM. Kết quả cho thấy, nồng độ probe 0,05 µM lên ở chu kỳ ngưỡng sớm nhất cũng như tín hiệu huỳnh quang ổn định nhất (Hình 3.6). Do đó, nồng độ 0,05 µM được lựa chọn do là nồng độ thấp nhất nhưng vẫn cho kết quả Ct đáng tin cậy.
Hình 3. 7. Tối ưu nồng độ mồi 0,05 µM
Tiếp tục khảo sát nồng độ mồi ở các mức 0,1 µM, 0,2 µM; 0,3 µM; 0,4 µM; 0,5 µM. Kết quả cho thấy nồng độ mồi có độ tin cậy cao là 0,2µM (Hình 3.7). Do đó, nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng real-time PCR BKV- DNA là 0,2µM.
Từ các kết quả tối ưu nồng độ probe và nồng độ mồi, các thành phần của phản ứng real-time PCR được xác định (Bảng 3.1)
Bảng 3. 1. Thành phần phản ứng real-time PCR
STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (µl)
1 Quantitect Probe master mix 1X 10
2 Primer (F+R) 5 µM 0,2 µM 0,8
3 Probe 5 µM 0,05 µM 0,2
4 Nước đã khử ion DNA/RNAase free 0
5 DNA template 9
Tổng 20
Chu trình nhiệt được xác định như sau:
(50oC x 2 phút) (95oC x 15phút) (94oC x 15 giây, 58oC x 60 giây) x 45 chu kỳ, duy trì ở 7o
C.
2X Quantitect probe PCR Mastermix là hỗn hợp bao gồm HotStarTaq DNA Polymerase, QuantiTect Probe PCR Buffer và ROX passive reference dye. HotstarTaq DNA polymerase là một enzyme Taq DNA polymerase cải tiến, được cung cấp ở trạng thái enzyme không hoạt động trong điều kiện nhiệt độ môi trường. Khả năng tái hoạt động được kích hoạt khi bắt đầu phản ứng bằng bước ủ 95°C- 15 phút, qua đó ngăn chặn sự hình thành các sản phẩm ngoại lai và sự bắt cặp ngẫu nhiên giữa các mồi trong quá trình thiết lập phản ứng và bước biến tính đầu tiên, tăng khả năng đặc hiệu cho phản ứng PCR cũng như định lượng chính xác. Trong khi đó, QuantiTect Probe PCR Buffer chứa sự kết hợp cân bằng giữa KCl và (NH4)2SO4, giúp tăng khả năng cạnh tranh giữa sản phẩm đặc hiệu với liên kết mồi không đặc
hiệu trong bước ủ của mỗi chu kỳ PCR. Ngoài ra, với sự thay thế dTTP thành dUTP cộng thêm bổ sung uracil-N-glycosylase (UNG) cho phản ứng giúp đề phòng ngoại nhiễm với các sản phẩm PCR từ những lần chạy trước. Mặt khác, sự có mặt của thuốc nhuộm ROX cung cấp một đường cơ sở ổn định để tín hiệu huỳnh quang của PCR được chuẩn hóa. Như vậy, tất các các thành phần của phản ứng real-time PCR đã được tối ưu hóa nhằm đạt được hiệu suất khuếch đại tốt nhất.