+ Dòng tế bào khả biến Escherichia DH5α được cung cấp bởi hãng ThermoFisher Scientific, Hoa Kỳ.
+ Vector tách dòng: Vector pGEM T easy cho phép chèn các đoạn có kích thước 6 bp - 10 kp. Kích thước plasmid nhỏ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình biến nạp dễ dàng. Vector với hai đầu dính T giúp gắn kết đoạn chèn và vector dễ dàng hơn, thuận tiện cho quá trình thao tác. Sản phẩm PCR đầu bằng tạo bởi DNA polymerase có chức năng đọc sửa, sau khi được gắn thêm đầu A sẽ gắn trực tiếp vào vector trong vòng 5 phút với hiệu suất 99% sản phẩm DNA tái tổ hợp. Mặt khác, DNA tái tổ hợp có thể biến nạp vào tất cả các chủng E. coli trong phòng thí nghiệm. Vector pGEM T easy chứa gen kháng kháng sinh ampicilin nên các tế bào nhận vector có thể mọc trên môi trường chọn lọc ampicilin. Mặt khác, ở vị trí đa điểm có chứa gen lac Z bị gián đoạn bởi đoạn chèn. Vì vậy, chỉ có những vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp mới mọc thành khuẩn lạc có màu trắng. Những khuẩn lạc
không chứa đoạn chèn sẽ có màu xanh do gen lacZ hoạt động, mã hóa cho enzyme βgalactosidase, kết hợp với cơ chất X-gal và IPTG tạo sản phẩm có màu xanh.
+ Bộ mẫu chuẩn được thiết lập bởi hãng Altona (RealStar® BKV PCR Kit, Đức, 2018)
Đây là bộ mẫu chuẩn đã được hiệu chỉnh từ bộ mẫu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới về BKV, đã được cấp chứng chỉ IVD (In vitro diagnostic) của châu Âu. Bộ mẫu chuẩn định lượng chứa DNA đặc hiệu BKV có dải nồng độ từ 1.00E+01 đến 1.00E+4 [IU/µl]. Độ nhạy của kỹ thuật real-time PCR trung bình phát hiện được là 0,712 copy/μl (dao động từ 0,404 – 1,693 copy/μl, với độ tin cậy 95%). Độđặc hiệu cũng được đánh giá trên những chủng polyomavirus khác hoặc trên những mầm bệnh có ý nghĩa ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch như: Cytomegalovirus, Epstein- Barr virus, Hepatitis A virus, Hepatitis B virus, Hepatitis C virus, Herpes simplex virus 1, Herpes simplex virus 2, Human herpesvirus 6A, Human herpesvirus 6B, Human herpesvirus 7, Human herpesvirus 8, Human immunodeficiency virus 1, JC virus, Simian virus 40, Varicella-zoster virus.
+ Bộ mẫu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (1st WHO International Standard for BK Virus DNA (2016, NIBSC code: 14/212)
Vào năm 2006 và năm 2008, Tổ chức Y tế thế giới đã tổ chức một cuộc họp quốc tế để thảo luận về yêu cầu tiêu chuẩn hóa quốc tế các xét nghiệm BKV NAT (BKV nucleic acid test) với sự tham gia của các giáo sư từcác trường đại học, công ty công nghiệp dược phẩm, các đơn vị ngoại kiểm (QCMD: Quality Control Molecular Diagnostics) và các tổ chức chính phủ (NIBSC: National Institute of Biologicals and Standards Control). Hai mẫu chuẩn BKV đông khô (subtype I/b-1 và subtype I/b-2) được pha trong 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,5% albumin huyết thanh người, 0,1% D - (+) - Trehalose dehydrate được gửi tới 33 phòng thí nghiệm từ 15 quốc gia phân tích đánh giá, mỗi phòng thí nghiệm sử dụng các xét nghiệm thường quy để phát hiện và định lượng BKV. Kết quả khảo sát cho thấy trong 2 mẫu chuẩn thì mẫu chuẩn thứ 2 (code: 14/212) phù hợp nhất để sử dụng làm mẫu
chuẩn quốc tế của WHO. Đây cũng là bộ mẫu chuẩn được lựa chọn đểđánh giá chất lượng bộ mẫu chuẩn cũng như kỹ thuật real-time PCR tự phát triển trong nghiên cứu này.
Hình 2. 1. Vector pGEM T easy