Để phân tích kiểu gen BKV, 26 trình tự tham chiếu bao gồm tất cả các kiểu gen BKV (thu thập từ ngân hàng gen Quốc tế) cùng với các trình tự BKV thu thập từ bệnh nhân ghép thận tại Việt Nam được so sánh dựa vào phần mềm Bioedit 7.0. Tiếp tục phân tích, loại bỏ các trình tự thừa và những giá trịgap trước khi xây dựng cây chủng loại bằng phần mềm Mega 7 (www.megasoftware.net). Cây chủng loại được xây dựng dựa vào phương pháp khoảng cách (NJ) với giá trị bootstrap lặp lại 1000 lần.
2.3.3.2. Phân tích đa hình đơn nucleotide (SNP: Single Nucleotide Polymorphism)
SNP được định nghĩa là một thay đổi base đơn lẻ trên một chuỗi trình tự DNA mà sựthay đổi đó chiếm một tỉ trọng đủ lớn (trên 1%) trong một cộng đồng
lớn. Để xác định những vị trí SNP trong vùng gen VP1 (1630-1956) của BKV trên những bệnh nhân ghép thận tại Việt Nam, phương pháp giải trình tựđược lựa chọn. Các bước phân tích SNP như sau:
- PCR và giải trình tự vùng gen VP1 (1630-1956). - So sánh các trình tựthu được bằng phần mềm Bioedit
(www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)
- Xây dựng cây chủng loại phát sinh đểxác định kiểu gen BKV dựa vào phần mềm Mega 7.
- Từ kiểu gen xác định, tiến hành so sánh trình tự của các kiểu gen với nhau và trình tự của các phân nhóm trong cùng một kiểu gen để xác định vị trí đa hình cũng như sự thay thế axit amin tại những vị trí này.
2.3.3.3. Phân tích SNP theo cặp (máu+nước tiểu) ở những bệnh nhân BKVN
Các trường hợp BKVN (khẳng định bằng sinh thiết thận) được lựa chọn để phân tích kiểu gen BKV theo cặp (máu và nước tiểu) với các bước cụ thểnhư sau:
- DNA tổng số tách từ huyết tương và nước tiểu của bệnh nhân BKVN được PCR bằng cặp mồi đặc hiệu BKS/AS.
- Giải trình tự gen theo nguyên lý Sanger.
- Xác định kiểu gen BKV bằng phương pháp xây dựng cây chủng loại phát sinh. - So sánh kết quả giải trình tự gen theo từng cặp để xác định các vị trí SNP (so với chủng Dunlop) dựa vào phần mềm bioedit.
2.3.3.4. Đánh giá vai trò của kiểu gen BKV với bệnh thận do BKV
Từ kết quả xây dựng cây chủng loại phát sinh, xác định được kiểu gen BKV. Tiếp tục đánh giá vai trò của kiểu gen với các đặc điểm lâm sàng như tuổi, giới tính, nồng độ BKV-DNA trong máu, nồng độ BKV-DNA trong nước tiểu, nồng độ creatinin, sự khác biệt HLA và tình trạng BKVN. Sử dụng phần mềm thống kê sinh học SPSS (Version 20) để phân tích mối tương quan giữa kiểu gen với các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ghép thận qua các kiểm định khi bình phương cho biến định tính, T student và MannWhithney cho biến định lượng.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN