pháp tủa ammonium sulfate
Dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 có chứa kháng thể kháng kháng nguyên A cùng với các protein và kháng thể có nguồn gốc từ huyết thanh bò (Fetal Bovine Serum – FBS). Tuy nhiên, khi kiểm tra độ đặc hiệu của kháng thể có trong dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 với bộ hồng cầu mẫu A+, B+, O+ thì kháng thể trong dịch nuôi cấy chỉ nhận diện đặc hiệu kháng nguyên A trên màng hồng cầu. Do vậy dịch nuôi cấy chứa kháng thể kháng kháng nguyên A có lẫn tạp với các protein và huyết thanh của bò không ảnh hƣởng đến độ đặc hiệu của kháng thể kháng nguyên A. Nhƣ vậy, có thể sử dụng trực tiếp dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 để làm thuốc thử xác định nhóm máu A. Tuy nhiên trong các bộ sinh phẩm xác định nhóm máu đã đƣợc thƣơng mại, các kháng thể kháng A, kháng B và kháng AB đƣợc pha với các chất màu khác nhau để có thể phân biệt và tránh nhầm lẫn xảy ra khi xác định nhóm máu. Đối với kháng thể kháng A, sản phẩm thƣơng mại có màu xanh. Để tạo màu cho sản phẩm cần tiến hành pha dịch nuôi cấy tế bào với chất màu. Tuy nhiên, trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào có sử dụng chất chỉ thị môi trƣờng là phenol đỏ do vậy để tạo màu xanh cho sản phẩm trƣớc hết cần phải tiến hành loại bỏ phenol đỏ khỏi dịch nuôi cấy tế bào. Để loại bỏ phenol đỏ thì phƣơng pháp đơn giản nhất là tủa bằng ammonium sulfate. Nhƣ vậy,
chúng tôi tinh sạch kháng thể bằng phƣơng pháp tủa với ammonium sulfate bão hòa 50% với mục đích loại bỏ phenol đỏ ra khỏi dịch nuôi cấy. Để thấy rõ khả năng loại bỏ phenol bằng phƣơng pháp tủa ammonium sulfate, chúng tôi tiến hành nuôi cấy và thu lƣợng nhỏ dịch nuôi cấy sau khi tế bào phát triển đến pha log. Thu dịch nuôi cấy lúc này vì vẫn nhìn rõ màu phenol đỏ còn thu sau khi tế bào chết hoàn toàn thì lúc này môi trƣờng đã chuyển vàng. Sau khi dịch nuôi cấy đƣợc tủa với ammonium sulfate, tiến hành ly tâm để thu cặn có chứa kháng thể và loại bỏ dịch nổi có chứa phenol đỏ. Tủa sau đó đƣợc rửa để loại bỏ hoàn toàn phenol đỏ và tái huyền phù vào đệm PBS 1X. Không quan sát thấy sự hiện diện của phenol đỏ sau khi tái huyền phù tủa vào đệm. Nhƣ vậy, chúng tôi đã loại bỏ thành công phenol đỏ ra khỏi kháng thể.
Hình 3.18. Dịch nuôi cấy trƣớc và sau khi tủa ammonium sulphate
Sau khi tinh sạch, kháng thể đƣợc làm phản ứng ngƣng kết trên phiến kính với hồng cầu mẫu A+ và B+ để đánh giá lại độ đặc hiệu của kháng thể có thay đổi sau khi tủa muối hay không. Nhận thấy rằng, kháng thể trƣớc và sau khi tủa muối (cô đặc 5 lần hoặc hòa về bằng với thể tích ban đầu) đều chỉ nhận diện đặc hiệu kháng nguyên A. Nhƣ vậy, độ đặc hiệu của kháng thể sau khi tủa muối không thay đổi nhƣng cƣờng độ ngƣng kết thì thay đổi. Kháng thể đƣợc cô đặc 5 lần thì cƣờng độ ngƣng kết mạnh hơn so với dịch nuôi cấy ban đầu còn kháng thể sau tủa đƣợc hòa về thể tích bằng với thể tích ban đầu thì cƣờng độ ngƣng kết giảm đi. Điều này có thể là do hàm lƣợng kháng thể bị thay đổi, trong quá trình tủa thì không phải toàn bộ kháng thể mong muốn đều tủa mà nó thể bị mất một phần do vậy hàm lƣợng kháng thể giảm đi dẫn đến
cƣờng độ ngƣng kết giảm, còn khi cô đặc thì hàm lƣợng kháng thể tăng lên từ đó cƣờng độ ngƣng kết có thể tăng theo.
Hình 3.19. Độ đặc hiệu của kháng thể trƣớc và sau khi tủa
Để xem xét có phải hàm lƣợng kháng thể bị giảm đi sau tủa hay không thì chúng tôi tiến hành xác định hiệu giá của kháng thể trƣớc và sau khi tủa (cô đặc và hòa về thể tích bằng thể tích ban đầu). Kết quả hiệu giá cho thấy, kháng thể sau khi tủa có hàm lƣợng tƣơng đƣơng với với hàm lƣợng có trong dịch nuôi cấy ban đầu (hiệu giá 27), còn khi cô đặc (thể tích giảm 1/5 so với ban đầu) thì hàm lƣợng kháng thể tăng lên 4 lần đạt 29.
Hình 3.20. Hiệu giá kháng thể trƣớc và sau khi tủa ammonium sulfate
Mặc dù hàm lƣợng kháng thể trƣớc và sau khi tủa không thay đổi nhƣng cƣờng độ ngƣng kết của kháng thể lại giảm đi. Điều này có thể là do một thành phần nào đó trong dịch nuôi cấy tế bào có ảnh hƣởng đến cƣờng độ của phản ứng ngƣng kết hồng cầu đã bị loại bỏ. Trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào có bổ sung thêm huyết thanh bò
mà thành phần chính của huyết thanh là BSA, BSA lại có tác động làm tăng tƣơng tác kháng nguyên kháng thể mà sau khi tủa thì hàm lƣợng BSA giảm đi do đó ảnh hƣởng đến cƣờng độ ngƣng kết của phản ứng kháng nguyên – kháng thể [9].
3.10. Tạo sinh phẩm xác định nhóm máu A
Các thuốc thử thử anti-A đã đƣợc thƣơng mại có màu xanh do vậy chúng tôi cần xác định đƣợc chất màu bổ sung vào trong sinh phẩm. Theo patent WO 2012083361, màu xanh trong thuốc thử anti-A thƣơng mại là patent blue V. Patent blue V là chất màu axit với 2 nhóm sulphonic, phân ly trong nƣớc và tích điện âm do vậy nó có thể hòa tan nhanh vào nƣớc [3]. Để tạo đƣợc màu tƣơng ứng nhƣ các sản phẩm thƣơng mại chúng tôi tiến hành xác định hàm lƣợng chất màu bổ sung vào trong sinh phẩm. Hàm lƣợng của patent blue V bổ sung vào sinh phẩm là 0,000035 g/ml.
Thuốc thử nhóm máu đƣợc sử dụng trong điều kiện bình thƣờng không vô trùng mà kháng thể có bản chất là protein dễ bị phân cắt bởi các protease. Trong không khí có rất nhiều vi khuẩn, để tránh nhiễm khuẩn vào mẫu kháng thể dẫn đến sự sản xuất protease làm kháng thể bị phân cắt và mất hoạt tính thì chúng tôi tiến hành bổ sung chất bảo quản là sodium azide với hàm lƣợng là 0,01% để ngăn cản sự tạp nhiễm vi sinh vật vào trong sinh phẩm. Phản ứng ngƣng kết hồng cầu xảy ra hiệu quả trong môi trƣờng muối có nồng độ ion thấp, thông thƣờng là sử dụng saline do vậy sử dụng đệm phosphate (PBS) để làm đệm pha kháng thể sau tinh sạch. Kháng thể của chúng tôi đƣợc sử dụng để xác định nhóm máu do đó chúng tôi bổ sung thêm thành phần chống đông cho máu là EDTA với nồng độ cuối cùng là 10 mM EDTA. Nhƣ vậy chúng tôi đã xác định đƣợc các thành phần bổ sung vào trong sinh phẩm của chúng tôi: chất màu (Paten blue V sodium salt), chất chống vi sinh vật (sodium azide), môi trƣờng vật lý cho phản ứng ngƣng kết hồng cầu (đệm PBS 1X) và chất chống đông (EDTA).
Dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp tủa với ammonium sulfate để loại bỏ phenol đỏ. Sau khi tủa, tủa kháng thể đƣợc rửa 2 lần với ammonium sulfate bão hòa 50%. Tủa sau khi rửa sẽ đƣợc huyền phù lại với đệm pha sinh phẩm với thể tích bằng 1/5 thể tích ban đầu. Thành phần đệm pha sinh phẩm A (0,0035% Patent blue V sodium salt + 0,01% sodium azide + 10mM EDTA trong PBS 1X, pH=7,8). Sau khi tạo sinh phẩm chúng tôi làm phản ứng ngƣng kết hồng cầu
trên phiến kính để đánh giá độ đặc hiệu, cƣờng độ ngƣng kết và ái tính của sinh phẩm. Kết quả cho thấy sinh phẩm xác định nhóm máu A mà chúng tôi tạo ra đảm bảo các yêu cầu đối với thuốc thử xác định nhóm máu A thƣơng mại: sinh phẩm có màu xanh, sinh phẩm chỉ đặc hiệu kháng nguyên A với cƣờng độ (4+) ≥3+, ái tính (2 giây) ≤10 giây, hiệu giá (512) ≥128 [18].
Hình 3.21. Sinh phẩm A và phản ứng ngƣng kết hồng cầu của sinh phẩm với panel hồng cầu hệ ABO
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
- Chúng tôi đã thành công trong việc xây dựng phƣơng pháp để tạo tế bào lai sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A: thu nhận đƣợc 6 hỗn hợp tế bào lai và 12 dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A, chọn đƣợc dòng A6G11C9 là dòng sản xuất kháng thể tốt nhất.
- Đánh giá đƣợc một vài tính chất của kháng thể do dòng tế bào lai A6G11C9 sản xuất: kháng thể có phân lớp chuỗi nặng IgM, chuỗi nhẹ kappa, kháng thể chỉ đặc hiệu kháng nguyên A với cƣờng độ ngƣng kết 3+ và ái tính 2s, hiệu giá kháng thể đạt 29. - Đã tạo đƣợc sinh phẩm A xác định nhóm máu.
Kiến nghị
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng anh
1. Abhyankar A.V. (2012), “Indigenously developed monoclonal antibody specific for human blood group B”. Journal of Hematological Malignancies, (2), pp.24-18.
2. ATTC (2011), Animal Cell Culture Basic: Tips and techniques for continuous cell
line.
3. Ballerini D.R., Li X., Shen W. (2012), Method and system for detection of blood types, Patent number WO 2012083361 A1.
4. Costabile M. (2010), “Determining the reactivity and titer of serum using a haemagglutination assay”, Journal of Visualized Experiments, (35), pp.1752.
5. Dean L. (2005), “Chapter 1. Blood and the cells it contains”, Blood groups and red
cell antigens, National Center for Biotechnology Information, Bethesda (MD).
6. Dean L. (2005), “Chapter 2. Blood group antigen are surface marker on the red blood cell membrane”, Blood groups and red cell antigens, National Center for Biotechnology Information, Bethesda (MD).
7. Dean L. (2005), “Chapter 3. Blood transfusionand the immune system”, Blood groups and red cell antigens, National Center for Biotechnology Information,
Bethesda (MD).
8. Edward A.G. (2014), Antibodies: A laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
9. Fitzsimmons J.M. and Morel P.A. (2003), “The effects of red blood cell suspending media on hemagglutination and the antiglobulin test”, Transfution, (19), pp.85-81. 10. Fulle A., Takahashi M. and Hurrell J.G.R. (1992), “Immunization of Mice”,
Current Protocols in Molecular Biology.
11. Grodzki A.C. and Berenstein E., (2010), “Antibody Purification: Ammonium sulfate fractionation or gel filtration”, Springer.
12. Hayter P.M. (1989), An Investigation into factors that affect monoclonal antibody
production by hybridomas in culture, Department of microbiology university of Surrey
13. Institutional Animal Care and Use Committee (2012), Footpad Injections Guidelines in Mice and Rats, the University of North Carolina at Chapel Hill.
14. Iyer Y.S., Vasantha K., Manisha P., Jadhav S., Gupte S.C. and Mohanty D. (2006), “Production of murine monoclonal anti-B”, Indian Journal Medicin Research, (123), pp. 561-564.
15. John B. Z. (2009), Essential Clinical Immunology, Cambridge University Press,
United Kingdom.
16. Kamala T. (2007), “Hock immunization: A humane alternative to mouse footpad injections”, Journal Immunol Methods.
17. Kanrko M., Kato Y., Horiuchi H. and Osawa M. (2003), “Molecular characterization of a human monoclonal antibody to B antigen in ABO blood type”,
Immunology Letters, (86), pp.51-45.
18. Kathy D .B. and Paula R.H (2013), Basic & Applied Concepts of Blood Banking and transfusion practices.
19. Khan F., Khan RH., Sherwani A., Mohmood S., Azfer MA., (2002). “Lectins as markers for blood grouping”, Medical Science Monitor, (8), pp. 300-293.
20. Kumagai I. and Tsumoto K., (2001), “Antigen–Antibody Binding”, Encyclopedia
of life science.
21. Lee GM, Huard TK and Palsson BO (1989), “Effect of serum concentration on hybridoma cell growth and monoclonal antibody production at various initial cell densities”, Hybridoma, (8), pp.75-369.
22. Levy M., Edelman L. and Dighiero G (2001), “Molecular characterization of a monoclonal murine anti-blood group A antibody”, Immunology Letters, (76), pp.23-
15.
23. National Research Council (1999), Monoclonal Antibody Production, National
Academy Press, Washington.
24. Ozzturk S. S. and Palsson O. B. (1990), “Effect of initial cell density on hybridoma growth, metabolism, and monoclonal antibody production”, Journal Biotechnology,
25. Pandey S. (2013), “Hybridoma technology for production of monoclonal antibodies”, International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research,
(1), pp. 94 – 88.
26. Parham P (2009). The Immune System, third edition, Garland Science, London and NewYork.
27. Peter J.D. and Ivan M.R. (2000), “The Immune System”, The New England Journal of Medicine, (343), pp.49-37.
28. Sadiq F., Tissent A. , Habti N., Radallah D., Amrani N. E., Benchemsi N. (2005), “Production of a new anti-A monoclonal reagent”, African Journal of Bioteachnology, (4), pp. 846-844.
29. Shimizu S. (2004), “Routes of Administration”, The Laboratory Mouse, National
Institute of Animal Health, Tsukuba, Japan.
30. Wang S. (2011), “Advances in the production of human monoclonal antibodies”,
Antibody Technology Journal, 1, pp. 4-1.
Tài liệu tiếng việt
31. Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phƣơng, Đỗ Khắc Hiếu, Hà Thị Thu, Đinh Thƣơng Vân, Đinh Duy Kháng, Lê Trần Bình (2008), “Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng protein vỏ VP28 của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú”, Tạp chí Công
nghệ Sinh học, (2), Tr. 203–208.
32. Nguyễn Hải Đăng (2008), Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn
dòng kháng progesterone, Luận văn thạc sỹ, Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Hà
Nội.
33. Pham Văn Ty và Nguyễn Lân Dũng (2004), “Miễn dịch học”, Nhà xuất bản đại học quốc gia, Hà Nội.
Tài liệu Web
34. Bioatla (2015), Antibody Isotypes, http://bioatla.com/educational- appendix/antibody-isotypes, ngày 7/12/2015.
35. Bộ y tế (2013), Thông tƣ hƣớng dẫn hoạt động truyền máu, http://thuvienphapluat.vn/van-ban/The-thao-Y-te/Thong-tu-26-2013-TT-BYT-nam- 2013-huong-dan-hoat-dong-truyen-mau-214176.aspx, ngày 12/7/2015.
36. Immunology Module (2015), The innate and adaptive immune systems, http://missinglink.ucsf.edu, ngày 12/7/2015.
37. International Society of Blood Transfusion (2014), Table of blood group systems v4.0, http://www.isbtweb.org, ngày 12/7/2015.
38. Jerry R. B (2015), Blood transfusion, http://www.medicinenet.com, ngày 7/12/2015. 39. Wikipedia (2015), Blood transfusion, https://en.wikipedia.org, ngày 7/12/2015. 40. http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/phagocytosis, ngày 7/12/2015. 41. http://www.novimmune.com/science/antibodies.html, ngày 7/12/2015.
42. http://www.buzzle.com/articles/blood-types-chart.html, ngày 7/12/2015.
43. http://www.nature.com/nbt/journal/v25/n12/fig_tab/nbt1363_F1.html, ngày 7/12/2015. 44. http://www.whatisthebiotechnology.com/blog/hybridoma-technology/, ngày 7/12/2015.