Nuôi cấy tế bào động vật khó hơn nuôi cấy vi sinh vật bởi vì chúng yêu cầu nhiều dinh dƣỡng hơn và thông thƣờng chỉ sinh trƣởng trên một bề mặt đặc biệt. Mặc dù vậy, nhiều tế bào động vật khác nhau bao gồm tế bào biệt hóa và không biệt hóa đã đƣợc nuôi cấy thành công.
Tế bào động vật không thể tổng hợp đƣợc các amino acid thiết yếu và sự sinh trƣởng của tế bào động vật trong nuôi cấy cần cung cấp 9 axit amin này (histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan và valine). Ngoài ra, nuôi cấy tế bào động vật thƣờng yêu cầu thêm cysteine, glutamine và tyrosine. Các thành phần thiết yếu khác của môi trƣờng cần cho nuôi cấy tế bào động vật là vitamin, muối vô cơ, carbohydrate (glucose…) và huyết thanh. Huyết thanh là một hỗn hợp gồm hàng trăm protein và nhiều yếu tố khác cần cho sự biệt hóa của tế bào của tế bào trong nuôi cấy. Insuline trong huyết thanh là một hormone đƣợc yêu cầu cho sự sinh trƣởng của tế bào động vật có xƣơng sống…Mặc dù tế bào động vật có thể sinh trƣởng trên môi trƣờng không huyết thanh vì các loại tế bào này yêu cầu yếu tố sinh trƣởng đặc biệt không có mặt trong huyết thanh. Ví dụ, tế bào tiền thân tạo máu yêu cầu hormone erythropoietin và tế bào lympho T của hệ thống miễn dịch yêu cầu interleulin – 2. Các yếu tố này bám vào protein thụ thể trên màng tế bào tạo ra tín hiệu để tế bào tăng sinh.
Trong mô động vật nguyên vẹn, hầu hết các tế bào liên hệ chặt chẽ và tƣơng tác với các tế bào khác thông qua một loạt cầu nối tế bào. Các tế bào cũng liên hệ với chất nền ngoại bào (một mạng lƣới phức tạp các protein tiết và carbohydrate để lấp đầy khoảng trống giữa các tế bào). Chất nền đƣợc tiết bởi chính các tế bào giúp tế bào liên kết với các tế bào khác trong mô. Chất nền ngoại bào bao gồm các thành phần: collagen, axit hyaluronic, mucopolysaccharise, proteoglycan, glycoprotein. Tế bào đông vật in – vivo có xu hƣớng tƣơng tác với nhau và với chất nền ngoại bào. Không giống nhƣ vi khuẩn và nấm men có thể sinh trƣởng ở trạng thái lơ lửng, hầu hết tế bào động vật đều cần bề mặt rắn đặc biệt đƣợc phủ chất nền ngoại bào (ECM – extracellular matrix) để sinh trƣởng. Chất nền ngoại bào đóng vai trò nhƣ cầu nối để liên kết các tế bào lại với nhau.
Sự sinh trƣởng của tế bào động vật tƣơng tự nhƣ sự sinh trƣởng của hầu hết vi sinh vật và đƣợc nghiên cứu bằng cách phân tích đƣờng cong sinh trƣởng khi nuôi cấy theo mẻ. Tức là tế bào động vật đƣợc nuôi cấy trong hệ thống kín, trong quá trình nuôi cấy không thay đổi môi trƣờng và thời gian nuôi cấy càng kéo dài thì nồng độ chất dinh dƣỡng càng giảm sút, các chất thải trong trong môi trƣờng tăng lên. Sự sinh trƣởng của tế bào động vật trải qua 4 giai đoạn. Trong suốt giai đoạn đầu đƣợc gọi là lag phase, số lƣợng tế bào ít thay đổi do tế bào ít hoặc hầu nhƣ không phân chia mà chủ yếu chỉ thích ứng với môi trƣờng mới. Sau đó, tế bào bắt đầu bƣớc vào giai đoạn sinh trƣởng theo cấp số nhân đƣợc gọi là log phase (hay exponential growth phase) làm gia tăng kích thƣớc quần thể với thời gian nhân đôi từ 18 đến 24 giờ (đối với tế bào lai chuột là 12 đến 24 giờ), sự sinh sản của tế bào chủ yếu đƣợc thực hiện trong giai đoạn này với thời gian thế hệ tối thiểu, mật độ tế bào tối đa đạt đƣợc trong nuôi cấy tĩnh là 106 tế bào/ml. Trong nuôi cấy theo mẻ, sự sinh trƣởng theo cấp số nhân thƣờng đƣợc theo sau bởi giai đoạn chuyển tiếp và đạt đến giai đoạn cân bằng đƣợc gọi là stationary phase, đặc trƣng bởi sự giới hạn sinh trƣởng, sự cạn kiệt nguồn dinh dƣỡng, ức chế sản xuất hoặc tích tụ các sản phẩm độc hại. Đối với nuôi cấy tế bào động vật, tế bào sẽ ngừng sinh trƣởng khi đã hình thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt dụng cụ nuôi do sự ức chế tiếp xúc. Sau pha cân bằng tế bào đi vào giai đoạn cuối cùng đƣợc gọi là pha suy vong (death phase) đặc trƣng bởi số lƣợng tế bào chết vƣợt qua số lƣợng tế bào mới hình thành [2]. Một vài thông số quan trọng thƣờng đƣợc tính toán trong nuôi cấy tế bào đó là:
Số thế hệ là số lần mà tế bào phân chia (g)
Nt = No.2g g = log (Ne/No)/ln2= (log Nt – log No)/ln2
Tốc độ sinh trƣởng (k) là số thế hệ sinh ra trong một đơn vị thời gian thƣờng biểu thị bằng số thế hệ trong một giờ:
k = g/t = (log Nt – log No)/(t.ln2)
Thời gian thế hệ là thời gian cần thiết để số lƣợng quần thể tăng lên gấp đôi: T= 1/k
Trong đó:
Nt: Số lƣợng tế bào ở thời điểm t No: Số lƣợng tế bào ban đầu
Hình 1.14. Đƣờng cong sinh trƣởng của tế bào
Tốc độ sản xuất kháng thể không phụ thuộc vào tốc độ sinh trƣởng. Ví dụ, một số tác giả đã quan sát kháng thể tiếp tục đƣợc sản xuất ở giai đoạn cân bằng và trong một số trƣờng hợp tốc độ sản xuất khác thể đạt tối đa trong suốt giai đoạn cân bằng. Ngƣợc lại, một vài dòng tế bào lai cho thấy tốc độ sản xuất kháng thể giảm khi chúng đạt đến giai đoạn cân bằng. Động lực học sản xuất kháng thể có thể do một vài cơ chế ức chế, môi trƣờng cạn kiệt làm giảm đáng kể tốc độ sản xuất kháng thể của những tế bào này. Trái lại, Fazekas de St Groth (1983) đã kiểm tra một số dòng tế bào lai trong nuôi cấy liên tục và không thấy sự ực chế ngƣợc của sự tổng hợp kháng thể bởi tốc độ sản xuất kháng thể về cơ bản là giống nhau ở mật độ tế bào 105 và 106 tế bào/ml. Cơ chế hình thành động lực học kháng thể có thể đƣợc giải thích nhƣ sau: thứ nhất, kháng thể hình thành trong tế bào và đƣợc giải phóng trong suốt giai đoạn chết khi màng tế bào bị phân giải; thứ hai, tốc độ sản xuất kháng thể tăng trong suốt giai đoạn cân bằng. Một vài nghiên cứu đã cho thấy quần thể tế bào cân bằng đạt đƣợc tốc độ sản xuất kháng thể cao hơn trong suốt giai đoạn sinh trƣởng và tốc độ sản xuất kháng thể có liên quan đến số lƣợng tế bào sống [12, 21, 24].
Chƣơng 2. Vật liệu và phƣơng pháp 2.1. Vật liệu
2.1.1. Động vật
Chuột Balb/c đực thuần chủng (do Viện 103 cung cấp) đƣợc sử dụng làm vật chủ để gây miễn dịch.
2.1.2. Hồng cầu mẫu
Bộ hồng cầu mẫu ABO – Rh dƣơng 5% do Viện huyết học và truyền máu trung ƣơng cung cấp đƣợc sử dụng làm vật liệu gây miễn dịch và làm panel hồng cầu sàng lọc dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu.
2.1.3. Dòng tế bào myeloma
Dòng tế bào myeloma sp2/0 đƣợc sử dụng làm nguồn tế bào dung hợp có nguồn gốc từ chuột Balb/c.
2.1.3. Hóa chất
Môi trƣờng nuôi cấy tế bào động vật Dulbecco's Modified Eagle's Medium – DMEM của hãng Gibco (Mỹ). Huyết thanh Fetal Bovine Serum – FBS của hãng Sigma (Mỹ). Tá chất Freund’s complete adjuvant – FCA và Freund’s incomplete adjuvant – FIA của hãng Sigma (Mỹ). Môi trƣờng chọn lọc Hypoxanthine aminopterine thymine – HAT 50X, Hypoxanthine thymine – HT 50X của hãng Sigma (Mỹ). Chất bảo quản đông lạnh Dimethylsulfoxide – DMSO của hãng Sigma (Mỹ). Tác nhân dung hợp Polyethylene Glycol – PEG 50% 1500 của hãng Sigma (Mỹ). Kit xác định loại globulin miễn dịch Pierce® Rapid ELISA mouse mAb isotyping kit của hãng Thermo (Mỹ). Huyết thanh mẫu anti-A của hãng Biorad (Pháp). Các hóa chất khác đƣợc nhập từ hãng Merck (Đức). Bảng 2.1. Môi trƣờng sử dụng STT Môi trƣờng Thành phần 1 DMEM + 10% FBS (500 ml) 450 ml DMEM + 50 ml FBS 2 DMEM + 20% FBS (100 ml ) 80 ml DMEM + 20 ml FBS
3 DMEM + 1% FBS (100 ml )
99 ml DMEM + 1 ml FBS
4 HAT (100 ml) 88 ml DMEM + 10 ml FBS + 2 ml HAT 50X 5 HT (100 ml) 88 ml DMEM + 10 ml FBS + 2 ml HT 50X Bảng 2.2. Một số dung dịch STT Tên dung dịch Thành phần 1 NaCl 0,9% 9 g NaCl + 1000 ml H2O 2 PBS 1X, pH = 7.8 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4.2H2O, 0.24 g KH2PO4 vào 800 ml nƣớc deion. Chỉnh pH = 7.8 bằng NaOH 10N hoặc HCl 10N 3 (NH4)2SO4 bão hòa 100% (1 lít) 541,8 g (NH4)2SO4 sau đó bổ sung nƣớc đến thể tích 1000 ml
4 (NH4)2SO4 bão hòa 50% 500 ml dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa 100% vào 500 ml nƣớc deion
5 EDTA 0,5 M Cân 18, 612 g EDTA.Na.2H2O (M=372,24 g/mol) bổ sung vào 80 ml nƣớc deion. Dùng NaOH 10N để chỉnh pH=8. Bổ sung nuocs đến thể tích 100 ml
2.1.4. Máy móc thiết bị
Tủ nuôi cấy tế bào động vật (Panasonic, Nhật), Tủ cấy an toàn cấp 2 (Esco, Singapo), pipet điện cầm tay (Eppendorf, Mỹ), Máy li tâm (Eppendorf, Mỹ), Tủ lạnh (Sanyo, Nhật), Máy khuấy từ (Ika werke, Đức), Kính hiển vi phản pha (Olympus, Philipin), Bình bảo quản mẫu bằng nito lỏng (Taylor Wharton, Mỹ) và các máy móc khác.
2.2. Phƣơng pháp 2.2.1. Gây miễn dịch
Quá trình tiêm các kháng nguyên vô hại cùng với chất kích thích miễn dịch (tá chất) để kích thích cơ thể hình thành đáp ứng miễn dịch dịch thể đƣợc gọi là quá trình gây miễn dịch. Mục đích của việc gây miễn dịch để hoạt hóa các tế bào B đặc hiệu kháng nguyên để tạo tế bào lai. Trong đáp ứng miễn dịch dịch thể, khi cơ thể tiếp xúc với kháng nguyên qua quá trình gây miễn dịch với tá chất dẫn đến sự hoạt hóa và mở rộng dòng tế bào B đặc hiệu. Trong lần tiếp xúc kháng nguyên thứ 2, các tế bào lympho B biệt hóa thành tế bào plasma tiết kháng thể hoặc tế bào B nhớ. Hầu hết tế bào plasma có đời sống ngắn đƣợc duy trì trong cơ quan lympho thứ cấp (hạch lympho). Có rất nhiều con đƣờng gây miễn dịch cho chuột bao gồm: tiêm dƣới da, tiêm trong da, tiêm cơ, tiêm vào xoang bụng, tiêm tĩnh mạch, tiêm não, tiêm ngực, tiêm mũi. Gây miễn dịch qua bàn chân chuột là phƣơng pháp phổ biến đƣợc sử dụng để gây miễn dịch cho chuột. Đây là phƣơng pháp kết hợp giữa tiêm dƣới da và tiêm trong da. Các tế bào lympho sẽ đƣợc tập trung chủ yếu ở hạch lympho vùng kheo ở chân [10, 13, 16, 29].
* Quy trình:
- Chuẩn bị hồng cầu gây miễn dịch: Chuyển toàn bộ dung dịch hồng cầu mẫu 5% vào ống Falcon 15 ml đem ly tâm 1000 vòng/phút, 5 phút. Loại bỏ dịch nổi, thu cặn hồng cầu và tái huyền phù vào 10 ml nƣớc muối sinh lý, ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi, thu cặn hồng cầu. Lặp lại bƣớc này cho đến khi rửa hết sắc tố do hồng cầu vỡ giải phóng ra. Pha hồng cầu 5% để gây nhũ.
- Gây miễn dịch: Hồng cầu mẫu A 5% đƣợc gây nhũ với tá chất Freund (FCA hoặc FIA) theo tỉ lệ 1:1 để tạo thành nhũ tƣơng rồi tiêm khoảng 150 µl vào hai gan bàn chân sau của chuột Balb/c. Chuột đƣợc gây miễn dịch 3 lần trong đó lần tiêm đầu tiên sử dụng tá chất FCA và hai lần tiêm nhắc lại sử dụng tá chất FIA. Khoảng cách giữa các lần tiêm là 3 ngày.
2.2.2. Chuẩn bị tế bào nền
* Nguyên lý:
Khi nuôi các tế bào lai ngƣời ta thƣờng sử dụng lớp tế bào nuôi cấy nền, lớp tế bào này sẽ tiết các cytokine thúc đẩy quá trình dung hợp cũng nhƣ sự phát triển tế bào lai từ một tế bào. Lớp tế bào nền thƣờng sử dụng là đại thực bào. Các tế bào đại thực
bào có mặt chủ yếu ở các xoang cơ thể, đặc biệt là xoang bụng do đó ta có thể dễ dàng lấy tế bào đại thực bào từ bụng chuột. Các tế bào đại thực bào là tế bào đã biệt hóa hoàn toàn do vậy nó không có khả năng nhân lên khi nuôi cấy in-vitro do đó không
ảnh hƣởng đến sự phát triển của tế bào lai. Tế bào đại thực bào là tế bào bám dính do vậy khi nuôi cấy tĩnh nó sẽ có dạng dẹt [8, 25].
* Quy trình:
Chuột đƣợc gây mê bằng chloroform và khử trùng bằng cồn 70%. Từ xƣơng ức của chuột dùng kéo để rạch 1 đƣờng ngang nhỏ sau đó dùng panh kéo căng da bụng chuột và rạch 1 đƣờng dọc bụng chuột, kéo căng da chuột sang 2 bên sƣờn. Tiêm vào xoang bụng chuột khoảng 10 ml môi trƣờng (HAT dùng cho dung hợp hoặc DMEM dùng cho tách dòng) sau đó lắc nhẹ bụng chuột một vài lần để tế bào đại thực bào bong ra. Dùng xi lanh hút lấy khoảng 8 ml dịch từ xoang bụng và bổ sung vào 20 ml môi trƣờng, lắc đều. Chuyển 50 µl dịch vào các giếng của đĩa nuôi cấy 96 giếng. Nuôi tế bào trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 khoảng 24 giờ.
Hình 2.1. Tế bào đại thực bào khi nuôi cấy tĩnh
2.2.3. Nuôi cấy tế bào myeloma
* Nguyên lý
Dòng tế bào myeloma sp2/0 là dòng tế bào u tủy, không có khả năng sản xuất kháng thể nhƣng lại có thể sinh sản và phát triển nhanh trong nuôi cấy in-vitro, dòng tế bào này thiếu enzyme HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl tranferase) đƣợc sử dụng nhƣ marker chọn lọc dòng tế bào lai [25].
Chuyển ống giống chứa tế bào myeloma sp2/0 từ trong nitơ lỏng vào bể ổn nhiệt ở 37oC. Khi ống tế bào đã tan đá hoàn toàn, khử trùng phía ngoài ống bằng cồn 70%sau đó chuyển toàn bộ tế bào trong ống giống sang ống 15 ml và bổ sung 10 ml môi trƣờng DMEM, ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút (DMSO gây độc cho tế bào, ly tâm để loại bỏ DMSO). Gạn bỏ lớp dịch nổi phía trên và hòa cặn tế bào vào 5 ml môi trƣờng DMEM + 10% FBS và chuyển tế bào sang chai nuôi cấy T25 cm2. Nuôi tế bào ở 37o
C, 5% CO2. Khi tế bào đã sinh trƣởng thành một lớp đơn liên tục thì tiến hành cấy truyền tế bào sang chai T75 cm2. Nuôi tế bào ở 37oC, 5% CO2 cho đến khi tế bào sinh trƣởng chiếm khoảng 80-90% bề mặt chai nuôi là giai đoạn tốt nhất để dung hợp.
2.2.4. Dung hợp và tạo dòng tế bào lai
* Nguyên lý
Các tế bào lympho đƣợc trộn với tế bào u tủy sẽ tạo thành cụm khi ly tâm. PEG sẽ phá tách các cụm tế bào ra và biến đổi cấu trúc lớp lipid trên màng tế bào từ đó phá vỡ một phần màng của hai tế bào cạnh nhau để sát nhập hai màng để tạo thành thành tế bào lai dị hợp. Vì PEG là một chất độc nên sử dụng ở mức tối thiểu. Các tế bào sau khi dung hợp đƣợc ly tâm để loại bỏ PEG và chuyển vào môi trƣờng chọn lọc HAT để nuôi cấy [8, 23].
* Quy trình
- 3 ngày sau lần gây miễn dịch cuối cùng, chuột đƣợc gây mê bằng chloroform, khử trùng chuột bằng cồn 70% và lấy máu ở tim để thu huyết thanh.
- Khử trùng chuột bằng cồn 70%, mổ chuột để thu lấy 2 hạch vùng kheo và lách. Rửa lách và hạch bẹn trong 5 ml môi trƣờng DMEM, rửa 3 lần.
- Tách tế bào lympho B từ lách và hạch vùng kheo của chuột: Chuyển lách và hạch vùng kheo vào rây, bổ sung một ít môi trƣờng vào rây và dùng chày nghiền nhẹ nhàng để tế bào lympho B tách ra. Dùng môi trƣờng DMEM tráng rây, chày để thu tế bào. Hút toàn bộ huyền phù tế bào chuyển vào ống Falcon 15 ml, ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
- Loại bỏ dịch nổi và tái huyền phù tế bào vào 5 ml NH4Cl 0,85% để phá hồng cầu. Bổ sung thêm 10 ml môi trƣờng DMEM. Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút.
- Loại bỏ dịch nổi và tái huyền phù tế bào vào 10 ml môi trƣờng DMEM. Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ NH4Cl.
- Loại bỏ dịch nổi và tái huyền phù tế bào vào 10 ml môi trƣờng DMEM.
- Đối với tế bào myeloma: Sử dụng 1 chai nuôi cấy T75 cm2 mỗi chai có chứa 20 ml huyền phù tế bào myeloma cho 1 con chuột. Lắc mạnh chai nuôi cấy cho tế bào bung ra khỏi bề mặt nuôi cấy và chuyển toàn bộ huyền phù tế bào vào ống Falcon 50 ml. Ly