* Nguyên lý
Các tế bào lympho đƣợc trộn với tế bào u tủy sẽ tạo thành cụm khi ly tâm. PEG sẽ phá tách các cụm tế bào ra và biến đổi cấu trúc lớp lipid trên màng tế bào từ đó phá vỡ một phần màng của hai tế bào cạnh nhau để sát nhập hai màng để tạo thành thành tế bào lai dị hợp. Vì PEG là một chất độc nên sử dụng ở mức tối thiểu. Các tế bào sau khi dung hợp đƣợc ly tâm để loại bỏ PEG và chuyển vào môi trƣờng chọn lọc HAT để nuôi cấy [8, 23].
* Quy trình
- 3 ngày sau lần gây miễn dịch cuối cùng, chuột đƣợc gây mê bằng chloroform, khử trùng chuột bằng cồn 70% và lấy máu ở tim để thu huyết thanh.
- Khử trùng chuột bằng cồn 70%, mổ chuột để thu lấy 2 hạch vùng kheo và lách. Rửa lách và hạch bẹn trong 5 ml môi trƣờng DMEM, rửa 3 lần.
- Tách tế bào lympho B từ lách và hạch vùng kheo của chuột: Chuyển lách và hạch vùng kheo vào rây, bổ sung một ít môi trƣờng vào rây và dùng chày nghiền nhẹ nhàng để tế bào lympho B tách ra. Dùng môi trƣờng DMEM tráng rây, chày để thu tế bào. Hút toàn bộ huyền phù tế bào chuyển vào ống Falcon 15 ml, ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
- Loại bỏ dịch nổi và tái huyền phù tế bào vào 5 ml NH4Cl 0,85% để phá hồng cầu. Bổ sung thêm 10 ml môi trƣờng DMEM. Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút.
- Loại bỏ dịch nổi và tái huyền phù tế bào vào 10 ml môi trƣờng DMEM. Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ NH4Cl.
- Loại bỏ dịch nổi và tái huyền phù tế bào vào 10 ml môi trƣờng DMEM.
- Đối với tế bào myeloma: Sử dụng 1 chai nuôi cấy T75 cm2 mỗi chai có chứa 20 ml huyền phù tế bào myeloma cho 1 con chuột. Lắc mạnh chai nuôi cấy cho tế bào bung ra khỏi bề mặt nuôi cấy và chuyển toàn bộ huyền phù tế bào vào ống Falcon 50 ml. Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi và tái huyền phù tế bào vào trong 10 ml môi trƣờng DMEM, ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút để rửa tế bào. Loại bỏ dịch nổi, tái huyền phù tế bào vào 10 ml môi trƣờng DMEM.
- Chuyển huyền phù tế bào lympho B và huyền phù tế bào myeloma vào ống Falcon 50 ml (tỉ lệ 5 tế bào lympho B:1 tế bào myeloma). Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút.
- Loại bỏ dịch nổi, tái huyền phù tế bào vào 10 ml môi trƣờng DMEM, ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút để rửa tế bào.
- Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào.
- Dùng xi lanh thêm 1 ml PEG 50% (khối lƣợng phân tử là 1500) đã đƣợc làm ấm từ trƣớc, nhỏ từng giọt một trong vòng 1 phút, vừa nhỏ vừa lắc đều ống Falcon.
- Bổ sung 1 ml môi trƣờng DMEM đã đƣợc làm ấm từ trƣớc, nhỏ từng giọt một trong vòng 1 phút, vừa nhỏ vừa lắc đều ống Falcon.
- Lắc đều ống Falcon trong 1 phút.
- Cuối cùng bổ sung 8 ml môi trƣờng DMEM đã đƣợc làm ấm từ trƣớc, nhỏ từng giọt một trong vòng 2 phút.
- Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút.
- Loại bỏ dịch nổi và tái huyền phù cặn tế bào vào môi trƣờng HAT. Sử dụng pipet đa kênh chuyển 150 µl huyền phù tế bào vào các giếng của đĩa 96 giếng mỗi đĩa đã có chứa khoảng 50 µl huyền phù tế bào đại thực bào.
- Sau 2-4 ngày, tế bào lai có thể quan sát đƣợc.
- Sau 4-6 ngày, loại bỏ môi trƣờng HAT và thay môi trƣờng HT để giảm độc lực của môi trƣờng HAT, mỗi giếng bổ sung khoảng 150 l môi trƣờng HT.
- Sau 4-6 ngày thay môi trƣờng (10-12 ngày sau dung hợp), kiểm tra khả năng sản xuất kháng thể của các tế bào lai bằng phản ứng ngƣng kết hồng cầu.