Quần thể tế bào lympho B đƣợc tách từ hạch và lách của chuột đƣợc dung hợp với tế bào myeloma sp 2/0 dƣới tác dụng của PEG 1500 50%. Sau khi dung hợp, tế bào đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc HAT (Hình 3.3).
Hình 3.3. Tế bào sau dung hợp
(Ảnh chụp vật kính 10X, thị kính 20X, độ phóng đại máy ảnh 5X)
Tế bào myeloma sp2/0 bị mất khả năng tổng hợp kháng thể và thiếu enzyme hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase (HGPRT). Đây là những enzyme cho phép tế bào tổng hợp purine cấp cứu sử dụng nguồn hypoxanthine. Ban đầu, sự vắng mặt của HGPRT không phải là vấn đề vì tế bào có thể sử dụng con đƣờng thay thế để tổng hợp purine. Tuy nhiên, khi tế bào đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng chứa aminoteprin, chúng không thể sử dụng con đƣờng khác và nó phụ thuộc hoàn toàn vào HGPRT để tồn tại. Còn tế bào lympho B có gen HGPRT khi tiếp xúc với kháng nguyên chúng sẽ biệt hóa thành tƣơng bào plasma sản xuất kháng thể kháng lại kháng nguyên gây miễn dịch. Tuy nhiên, tƣơng bào plasma là giai đoạn cuối cùng của quá trình biệt hóa do đó chúng không thể tiếp tục nhân lên đƣợc nữa. Chỉ tế bào lai mang đặc tính của cả tế bào myeloma (sinh trƣởng vô hạn) và tế bào lympho B (có gen HGPRT) mới có khả năng sinh trƣởng trong môi trƣờng HAT (Hình 3.4).
(Ảnh chụp vật kính 10X, thị kính 20X, độ phóng đại máy ảnh 8X)
Khoảng 4 ngày sau khi dung hợp, tế bào đƣợc soi dƣới kính hiển vi để đánh dấu các giếng có chứa tế bào lai. Trong tổng số 768 giếng dung hợp thì có 712 giếng chứa tế bào lai nhƣ vậy hiệu suất dung hợp đạt trên 92,7%. Mỗi giếng dung hợp có thể chứa một hoặc nhiều hơn một dòng tế bào lai và tốc độ sinh trƣởng của các dòng tế bào lai ở các giếng khác nhau là khác nhau: có dòng sinh trƣởng nhanh hơn, có dòng sinh trƣởng chậm hơn. Trong nuôi cấy tĩnh, tế bào lai là tế bào bán bám dính và có dạng tròn (Hình 3.4, Hình 3.5).
Hình 3.5. Tế bào lai sau 2 ngày dung hợp ở các giếng khác nhau
(Ảnh chụp vật kính 10X, thị kính 20X, độ phóng đại máy ảnh 5X)