Kháng thể đƣợc phân loại thành các phân lớp (isotype) có chức năng khác nhau trong đáp ứng với kháng nguyên. Phân lớp kháng thể đƣợc phân loại dựa vào sự khác nhau trong trình tự amio acid vùng hằng định của chuỗi nặng. Năm phân lớp kháng thể
A B O A B O A B O A B O Hồng cầu mẫu 1% A4D11A9 A4D11F2 A6G11B8 A6G11B10 A6G11C9 A6G11C6 A6G11D5 A6G11D7 A6G11E7 A7B4C11 A7D4G10 A7D4H8 2 9
chính đã đƣợc phân loại ở động vật có vú: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. Isotype kháng thể IgG và IgA đƣợc phân loại tiếp thành các phân lớp phụ (ví dụ ở ngƣời IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2). Bên cạnh chuỗi nặng, sự khác biệt trong trình tự amino acid vùng hằng định của chuỗi nhẹ cũng đƣợc phân loại thành 2 phân lớp là kappa và lamda.
Loại globulin miễn dịch của kháng thể có trong dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 đƣợc xác định bằng Pierce® Rapid ELISA mouse mAb isotyping kit (Thermo). Cƣờng độ màu của phản ứng Elisa đƣợc đo bằng máy đo quang phổ ở bƣớc sóng 450 nm có 2 giá trị OD>0,2 ở giếng hàng F và G tƣơng ứng với chuỗi nặng IgM và chuỗi nhẹ kappa. Nhƣ vậy, kháng thể do dòng tế A6G11C9 sản xuất có phân lớp chuỗi nặng là IgM và phân lớp chuỗi nhẹ là kappa tƣơng tự nhƣ dòng tế bào A907 sản xuất kháng thể kháng A trong báo cáo của Fouad Sadiq năm 2005 cũng có phân lớp chuỗi nặng là IgM [28].
Hình 3.10. Phản ứng ELISA xác định isotye kháng thể Bảng 3.1. Giá trị OD của phản ứng ELISA ở bƣớc sóng 450 nm
1 A 0.045 B 0.043 C 0.041 D 0.046 E 0.042 F 0.873 G 0.332 H 0.046
Phản ứng ELISA này không chỉ xác định isotype kháng thể mà còn là một phƣơng pháp để kiểm chứng xem dòng tế bào lai đã đơn dòng hay chƣa. Cơ chế kiểm soát sự tái sắp xếp gen globulin miễn dịch để chắc chắn rằng một tế bào đơn không thể
sản xuất hai chuỗi nhẹ, cơ chế kiểm soát gen chuỗi nặng và cắt ARN cho phép một dòng tế bào đơn có thể sản xuất nhiều chuỗi nặng. Tuy nhiên, đối với tế bào lai hầu nhƣ chỉ tiết một chuỗi nặng và một chuỗi nhẹ. Việc một dòng tế bào lai sản xuất 2 chuỗi nhẹ và nhiều chuỗi nặng nếu có xảy ra sẽ rất hiếm và việc phát hiện nhiều chuỗi nặng có thể dòng tế bào lai mong muốn có lẫn với các dòng tế bào lai khác. Theo kết quả thu đƣợc, dòng tế bào lai A6G11C9 chỉ sản xuất một chuỗi nặng và một chuỗi nhẹ nhƣ vậy dòng tế bào A6G11C9 chắc chắn là đơn dòng và chỉ sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên A.
3.6. Sự sinh trƣởng và sản xuất kháng thể của dòng tế bào lai A6G11C9 tiết kháng thể kháng kháng nguyên A