Đối với các tính trạng nông học phức tạp được quy định bởi nhiều gen như tính trạng năng suất, đặc biệt là cấu trúc bông, việc chỉnh sửa đồng thời nhiều gen là phương pháp hữu hiệu để khám phá cơ chế di truyền của tính trạng. Năm 2014, Kabin Xie và Yinong Yang đã tiến hành nghiên cứu hệ thống tRNA nội bào nhằm mục đích xây dựng hệ thống chỉnh sửa nhiều gen đồng thời. Trong quá trình hình thành tRNA trưởng thành trong tế bào, các RNaseP và RNaseZ sẽ cắt đặc hiệu ở hai đầu 5’ và 3’ một đoạn trình tự không tham gia vào cấu trúc loop/hairpin của tiền tRNA để sản sinh ra tRNA chức năng (Hình 7). Lợi dụng cơ chế này, Xie và cộng sự (2015) đã xây dựng các cấu trúc polycistronic tRNA-gRNA (PTG) chứa các đoạn lặp tRNA-gRNA scaffold để tạo ra đồng thời nhiều gRNA ở lúa. Sau khi các cấu trúc PTG được phiên mã trong tế bào thực vật, hệ thống tRNA-processing RNases nội sinh sẽ nhận biết thành phần tRNA và cắt chính xác để giải phóng các gRNA (Hình 7). Hơn nữa, promoter kiểm soát hoạt động của các gen mã hóa tRNA là một promoter mạnh, có khả năng liên kết với DNA polymerase III, chúng hoạt động ở hầu hết các tế bào và các giai đoạn phát triển khác nhau của tế bào. tRNA là một thành phần cơ bản trong tế bào và việc sản xuất nó được đảm bảo bởi một hệ thống bảo tồn và chính xác. Do đó hệ thống này có thể được sử dụng ở nhiều loài sinh vật khác nhau. Kết quả thử nghiệm cho thấy phương pháp này cho phép bất hoạt đồng thời bốn gen với hiệu suất chỉnh sửa trên cả hai alen từ 57% trở lên [42].
Hệ thống chỉnh sửa nhiều gen PTG cũng đã được áp dụng thành công ở ngô, tạo ra đột biến ở 6 gen khác nhau với tần số xuất hiện các đột biến InDel/SNP lên tới 50-100%. Các nghiên cứu khác ở lúa cho thấy tần số đột biến mất đoạn có thể xảy ra lên tới 35-70% ở protoplasts, tỉ lệ này thấp hơn ở mô sẹo hay cây chuyển gen [42].
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Hai giống lúa sử dụng trong nghiên cứu:
Giống lúa mô hình Nipponbare [41] : sử dụng để phân lập gen ANK1, ANK2
Giống lúa mô hình Kitaake: sử dụng để chuyển gen
Hạt giống lúa Nipponbarre và Kitaake do Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Pháp (IRD) cung cấp.
2.1.2. Plasmid
Hai vector được sử dụng trong quá trình tạo cấu trúc tăng cường biểu hiện gen:
-Vector tách dòng pGEM-T Easy (A1360, Promega) (Hình 8A).
-Vector biểu hiện pCAMBIA5300.OE (PC5300.OE) được cung cấp bởi Tiến sỹ Jean-Christophe Breitler (Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp và phát triển (Cirad), Pháp) (Hình 8B).
Các vector để tạo cấu trúc PTG nhằm ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9:
-pGTR mang các mảnh thành phần mã hóa tRNA, gRNA-scafold để xây dựng cấu trúc polycistronic tRNA-gRNA (PTG) (Hình 8C).
-pRGEB32 được sử dụng làm vector biểu hiện Cas9 và cấu trúc PTG đặt dưới sự kiểm soát của hai promoter hoạt động mạnh ở thực vật pUbi, pU3 (Hình 8D).
Hai vector này được cung cấp bởi TS. Lê Quang Hòa (Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội).
Hình 8. Cấu trúc các vector pGEM-T Easy (A), PC5300.OE (B), pGTR (C) và vector pRGEB32 (C).
2.1.3. Các chủng vi khuẩn và môi trường nuôi cấy
Tất cả các plasmid được nhân dòng trong chủng vi khuẩn Escherichia coli
TOP10 (Invitrogen). Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 (TS. Hoàng Thị Giang – Viện Di truyền Nông nghiệp) được sử dụng cho quá trình chuyển gen vào mô sẹo lúa. Các chủng vi khuẩn được lưu giữ, bảo quản ở -80°C.
2.2. Phương pháp
2.2.1. Phương pháp khử trùng hạt
Hạt lúa được loại bỏ vỏ và khử trùng bề mặt bằng ethanol 70% trong hai phút. Sau đó, được khử trùng bằng dung dịch Natri hypoclorit (Javel 4%) bổ sung 1-2 giọt Tween20 trong 30 phút. Loại bỏ các chất tẩy rửa và rửa sạch hạt bằng nước cất vô trùng (5-6 lần).
Các trình tự mã hóa (cDNA) và trình tự gen (gDNA) của các gen nghiên cứu được lấy từ trang MSU Rice Genome Annotation (Osa1) Release 7 (http://rice.plantbiology.msu.edu). Mồi được thiết kế cho các phản ứng PCR để nhân dòng gen; kiểm tra vector, phân tích cây chuyển gen; giải trình tự, sử dụng phần mềm Primer3plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi- bin/primer3plus/primer3plus.cgi). Độ đặc hiệu của mồi và cấu trúc bậc 2 (hairpin structure) cũng như khả năng bắt cặp giữa các mồi với nhau (primer dimer) được kiểm tra bằng phần mềm Oligo Analyzer Tool. Trình tự các cặp mồi được sử dụng trong đề tài này được trình bày trong bảng 1.
Bảng 1. Danh sách các mồi được sử dụng trong đề tài
Tên mồi Trình tự (5’ – 3’) Mục đích Sử dụng
Actin-F CATTCCAGCAGATGTGGATTG Sử dụng cho phản ứng PCR kiểm
tra cDNA, phản ứng qPCR đánh giá biểu hiện gen
Actin-R TCTTGGCTTAGCATTCTTGG
ANK1_F1 CCACGGGTTC CTCGTCTCTT CC
Ba cặp mồi dùng trong các phản ứng PCR lồng nhằm phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK1
ANK1_R1 GACAGGTAATTCAGGCAGCACGA G ANK1_F2 CATGGCGCCGCCTCACGC ANK1_R2 TTTATGCCCTACTTCCTTCTAACTT CAGATC ANK1_F2_attB1 ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctCATGG CGCCGCCTCACGC ANK1_R2_attB2 ggggaccactttgtacaagaaagctgggttTTTATG CCCTACTTCCTTCTAACTTCAGATC ANK2_F1 CGACTAACTCGATCTGCTCCTCGC Ba cặp mồi dùng trong các phản ứng PCR lồng nhằm phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK2
ANK2_R1 CCGTGATGTTCAACAGTCACCACC
ANK2_F2 AATGGTGGAGAAGTTGCTCTTCG
Tên mồi Trình tự (5’ – 3’) Mục đích Sử dụng
ANK2_F2-attB1 ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctAATGG
TGGAGAAGTTGCTCTTCG
ANK2_R2-attB2 ggggaccactttgtacaagaaagctgggttTTCAC
CTAGCCTCTGTGCTTGC
T7 TAATACGACTCACTATAGGG Kiểm tra sự có mặt của đoạn DNA
chèn trong vector pGEM-T Easy tái tổ hợp và giải trình tự vector
SP6 ATTTAGGTGACACTATAG
pUBI GGATGATGGCATATGCAGCAG
Kiểm tra sự có mặt của đoạn DNA chèn trong vector PC5300.OE tái tổ hợp và giải trình tự vector pCaMV35S TGACAGATAGCTGGGCAATG ANK1-S1 GTGACCTCCGCCTCTTCA ANK1-AS1 TGCCCTACTTCCTTCTAACTTC ANK2-S2 ACAGACGGAAAGATGTGGAGA ANK2-AS2 AAATCAGTGGCGTAGCACCT
HPT-OE-F TTCAGCTTCGATGTAGGAGG Kiểm tra vector, cây chuyển gen
mang cấu trúc PC5300.OE-ANK
HPT-OE-R AGAAGAAGATGTTGGCGACC
SPS-F TTGCGCCTGAACGGATAT
Đánh giá số bản sao T-DNA trong cây chuyển gen
SPS-R CGGTTGATCTTTTCGGGATG
CDS-ANK1-F CGCCAACGAGTCAGGTGCTA Sử dụng cho phản ứng qPCR đánh
giá mức độ biểu hiện của gen
ANK1 trong các dòng lúa chuyển gen
CDS-ANK1-R TGGCGTCCCACAGTCAGAAG
CDS-ANK2-F AACCGTGGCACACCACTTCA Sử dụng cho phản ứng qPCR đánh
giá mức độ biểu hiện của gen
ANK2 trong các dòng lúa chuyển gen
CDS-ANK2-R GAGCCACCCTTTGCAGCAGT
pU3-F GACCATGATTACGCCAAGCTTAAG
GAATCTTTAAACATACG Kiểm tra sự có mặt của gRNA
trong vector, cây chuyển gen
gRNA-R GGACCTGCAGGCATGCACGCGCTA
Tên mồi Trình tự (5’ – 3’) Mục đích Sử dụng
pUBI-F GCTTGTGCGTTTCGATTTGA Kiểm tra sự có mặt của protein
Cas9 trong vector, cây chuyển gen mang
Cas9-R CCGCTCGTGCTTCTTATCCT
HPT-F GCTCCAGTCAATGACCGCTG Kiểm tra sự có mặt của gen kháng
hygromycin trong vector, cây chuyển gen
HPT-R CTCGGAGGGCGAAGAATCTC
ANK1_Ex4_F1 CACGTTATCAACAAACCTCCTATC Kiểm tra đột biến trong các dòng
lúa chuyển gen CRISPR/Cas9- ANK1
ANK1_Ex4_R1 CTGACTATAGAACACAGACTTTCG
ANK2_Ex4_F2 CAGTTATCACGGTTATCATGTGC Kiểm tra đột biến trong các dòng
lúa chuyển gen CRISPR/Cas9- ANK2
ANK2_Ex4_R2 CGTAATCTTCATGCTTGGAAC
2.2.3. Tách chiết DNA, RNA, tổng hợp cDNA
Tách chiết DNA
DNA tổng số được tách chiết từ lá lúa. Tiến hành thu 2cm mẫu lá khi cây có 4-5 lá thật (khoảng 20-25 ngày tuổi), làm lạnh trong nito lỏng. DNA được tách chiết bằng phương pháp sử dụng CTAB của Doyle có cải tiến [9]. Trong đó, xác tế bào và protein được loại bỏ bằng CH3COOK và chloroform, DNA được thu lại dưới dạng kết tủa với isopropanol, và rửa với ethanol 70%. DNA được bảo quản ở -200C.
Thu mẫu bông non, tách chiết RNA, tổng hợp cDNA
Cây Nipponbare được gieo trồng với chu kỳ chiếu sáng 14 giờ/ngày tại nhà kính viện Di truyền nông nghiệp. Giai đoạn ra hoa sẽ được thúc đẩy bằng cách điều chỉnh thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày. Thu mẫu bông non ở 2 giai đoạn: Giai đoạn sớm (giai đoạn phát sinh trục bông và phân chia nhánh) và giai đoạn muộn (giai đoạn phát sinh hoa). Mẫu bông non sau khi thu lập tức được làm lạnh trong nito lỏng và bảo quản ở -800C.
RNA tổng số được tách chiết từ mẫu bông non, bằng Kit ”RNeasy Plant Mini Kit” (Qiagen), các mẫu RNA sau đó được xử lý gDNA bằng DNaseI (Thermo Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
cDNA được tổng hợp từ 1µg RNA tổng số (đã xử lý gDNA) bằng kit SuperScript® III Reverse Transcriptase (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Kiểm tra DNA, RNA
Nồng độ và độ tinh sạch của DNA/RNA được kiểm tra ở bước sóng OD260. Mẫu sạch, không bị nhiễm protein khi tỷ số 1,8< OD260/280 < 2,0 và không bị nhiễm các tạp chất khác khi tỷ số 1,8< OD230/260 < 2,0.
Kiểm tra tính toàn vẹn của DNA/RNA: Chất lượng hay độ bảo toàn nguyên vẹn của DNA/RNA (không bị đứt gãy) được kiểm tra bằng phương pháp điện di.
2.2.4. Phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2
Trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 được phân lập từ cDNA tổng số bằng phản ứng PCR lồng. Phản ứng PCR1 sử dụng cặp mồi ANK1_F1, ANK1_R1 đối với gen ANK1, ANK2_F1, ANK2_R1 đối với gen ANK2. Mồi được thiết kế trong vùng 5’UTR và 3’UTR của mỗi gen nhằm tăng tính đặc hiệu. Phản ứng PCR2 được thực hiện từ khuôn là sản phẩm của PCR1 với cặp mồi ANK1_F2, ANK1_R2 và ANK2_F2, ANK2_R2 nhằm khuếch đại toàn bộ đoạn trình tự mã hóa từ mã mở đầu cho đến mã kết thúc của mỗi gen tương ứng. Phản ứng PCR3 được thực hiện từ khuôn là sản phẩm của PCR2, sử dụng cặp mồi ANK1_F2-attB1, ANK1_R2-attB2 và ANK2_F2-attB1, ANK2_R2-attB2 nhằm gắn thêm trình tự tái tổ hợp attB1 và attB2 vào trình tự mã hóa của gen ANK1, ANK2 phục vụ đưa đoạn trình tự mã hóa của gen
ANK1, ANK2 vào vector siêu biểu hiện PC5300.OE (Các mồi sử dụng được trình bày trong Bảng 1).
Các phản ứng PCR lồng sử dụng kit “Phusion II High Fidelity DNA polymerase Kit” (F-549S/L, Thermo Scientific, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Vị trí các cặp mồi thiết kế được thể hiện trên hình 9.
Hình 9. Sơ đồ vị trí gắn mồi dùng phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK1
(A), ANK2 (B)
2.2.5. Đưa đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 vào vector pGEM-T Easy
Các sản phẩm PCR khuếch đại trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 là các mảnh DNA có đầu bằng, do đó một phản ứng gắn Adenin vào hai đầu sản phẩm tinh sạch của phản ứng PCR3 (attB1-ANK-attB2) được thực hiện nhằm đưa sản phẩm PCR3 vào vector pGEM-T Easy ở vị trí mở vòng T-T. Phản ứng gắn adenin được thực hiện bởi Dream Taq DNA polymerase (#FP0702 Fermentas) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm của phản ứng được gắn vào vector pGEM-T Easy nhờ T4 DNA ligase (A1360, Promega, USA). Plasmid được biến nạp vào E.coli
TOP10 bằng phương pháp sốc nhiệt. Vi khuẩn được sàng lọc trên môi trường LB bổ sung Ampicillin 100 mg/l, IPTG 0,1 M , X-Gal 50 mg/l. Các khuẩn lạc màu trắng sẽ được chọn và nuôi cấy tăng sinh riêng rẽ trong 10ml môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh Ampicillin 100 mg/l ở nhiệt độ 370C và lắc 200 vòng/phút qua đêm. Sau đó DNA plasmid sẽ được tách chiết bằng kit GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific). Sự có mặt của đoạn trình tự mã hóa gen trong vector được kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi T7, SP6 và cắt bằng cắt giới hạn EcoRI, sau đó được gửi đi giải trình tự. Kết quả trình tự thu được được so sánh với trình tự tham chiếu của gen trên cơ sở dữ liệu NCBI.
2.2.6. Ghép nối đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 vào vector PC5300.OE PC5300.OE
Đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 được đưa từ vector pGEM-T Easy sang vector biểu hiện PC5300.OE bằng kỹ thuật Gateway (Hình 10). Vector pGEM-T Easy được cắt mở vòng bằng enzyme SalI, sau đó được tinh sạch bằng 30% PEG 8000/30 mM MgCl2. 3µl (150ng) vector pGEM-T Easy đã mở vòng và 1 µl (150 ng) vector PC5300.OE được sử dụng cho phản ứng tái tổ hợp bằng kít Gateway BP Clonase II Enzyme Mix (INVITROGEN) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 2 µl của hỗn hợp sau phản ứng được biến nạp vào khuẩn E.coli TOP 10 bằng phương pháp sốc nhiệt. Các khuẩn lạc được chọn lọc trên đĩa môi trường LB chứa Kanamycin 50 mg/l. Các dòng tế bào mọc trên đĩa được sàng lọc bằng kỹ thuật PCR khuẩn lạc với cặp mồi pUbi, ANK1_R2 đối với gen ANK1 và pUbi , ANK2_R2 đối với gen ANK2.
Hình 10. Phản ứng tái tổ hợp giữa vector pGEM-T_CDS_ANK và vector PC5300.OE
Các plasmid tách chiết từ các dòng khuẩn lạc dương tính được kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn EcoRI và giải trình tự với 2 cặp mồi được trình bày trong bảng 1, vị trí các cặp mồi được thể hiện trên hình 11.
2.2.7. Thiết kế cấu trúc Polycistronic tRNA-gRNA (PTG) bất hoạt gen ANK1, ANK2 ANK2
*Phương pháp thiết kế gRNA
Các trình tự gRNA spacer được thiết kế bằng phần mềm CRISPRdirect tại địa chỉ (http://crispr.dbcls.jp/). Để xem xét khả năng cắt không đặc hiệu (off-target) của gRNA spacer đối với hệ gen của giống lúa Nipponbare, thông số “Specificity check” được lựa chọn là: Rice (Oryza sativa ssp. japonica) genome, Os- Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0 (Oct, 2011). Các trình tự gRNA spacer có chỉ số cắt không đặc hiệu thấp nhất được lựa chọn (Bảng 2).
Bảng 2. Trình tự gRNA-spacer gRNA-spacer Trình tự ANK1a CCTCTCCATTTAGCAGTTGAACA ANK1b GCCACTGATTTATGCAGTTCTGG ANK2c GTGGACACAGTCGCAAACCGTGG ANK2d TGGTGCTATGAAGATTTTATTGG Phần gạch chân là trình tự PAM.
*Thiết kế mồi tạo cấu trúc PTG
Các mồi được thiết kế để nối các mảnh tạo cấu trúc PTG bằng công nghệ Golden Gate theo nghiên cứu của Xie và cộng sự [42]. Hai mồi thành phần tạo một gRNA-spacer gối lên nhau dựa vào 4 nucleotide liên tiếp bất kỳ trong vùng spacer (Hình 12A), các mồi mang thêm trình tự cắt của các enzyme giới hạn (BsaI hoặc
Bảng 3. Các mồi sử dụng để tạo cấu trúc PTG
Tên mồi Trình tự (5’-3’)
ANK1a-F TA GGTCTCC GATTTATGCAGTTC gttttagagctagaa
ANK1a-R AT GGTCTCA AATCAGTGGC tgcaccagccgggaa
ANK1b-F TA GGTCTCC CTGCTAAATGGAG gttttagagctagaa
ANK1b-R AT GGTCTCA GCAGTTGAACA tgcaccagccgggaa
ANK2c-F TA GGTCTCC ACAGTCGCAAACCG gttttagagctagaa
ANK2c-R AT GGTCTCA CTGTGTCCAC tgcaccagccgggaa
ANK2d-F TA GGTCTCC TATGAAGATTTTAT gttttagagctagaa
ANK2d-R AT GGTCTCA CATAGCACCA tgcaccagccgggaa
L5AD5-F CG GGTCTC A GGCA GGATG GGCAGTCTG GGCA
ACAAAGCACCAGTGG
L3AD5-R TA GGTCTC C AAAC GGATG AGCGACAGC AAAC
AAAAAAAAAA GCACCGACTCG
S5AD5-F CG GGTCTC A GGCA GGATG GGCAGTCTG GGCA
S3AD5-R TA GGTCTC C AAAC GGATG AGCGACAGC AAAC
Trình tự nối giữa các mảnh DNA thành phần được gạch chân.
*Tổng hợp Polycistronic tRNA-gRNA (PTG) bằng phương pháp Golden Gate
Trong nghiên cứu này, mỗi gen được chỉnh sửa bằng hai gRNA tại hai vị trí lân cận hướng đích vào vùng exon 4 mỗi gen. Các mảnh tạo cấu trúc gRNA bất hoạt gen ANK1, ANK2 và bất hoạt đồng thời gen ANK1 và ANK2 được khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Scientific) với cặp mồi tương ứng chứa điểm cắt của BsaI, ngoại trừ 2 vùng đầu và
cuối của một cấu trúc sử dụng mồi chứa điểm cắt của FokI (L5AD5-F và L3AD5- R). Phản ứng sử dụng khuôn là vector pGTR (Bảng 3).
Hình 12. Nguyên tắc tạo cấu trúc Polycistronic tRNA-gRNA (PTG) bằng Golden Gate [42]
(A) Cách thiết kế mồi đặc hiệu cho mỗi gRNA spacer. (B) Nguyên tắc tạo một cấu trúc gRNA spacer hoàn chỉnh bằng Golden Gate. (C) Sơ đồ quy trình tổng hợp cấu trúc PTG hoàn chỉnh bằng Golden Gate.
Bảng 4.Các mảnh PCR thành phần cần tổng hợp với cặp mồi tương ứng Mảnh
PCR Mồi xuôi Mồi ngược Ký hiệu
Kích thước sản phẩm PCR (bp)
P1 L5AD5-F ANK1a-R L5AD-ANK1a 140
P2 ANK1a-F ANK1b-R ANK1a-ANK1b 190
P3 ANK1b-F L3AD5-R ANK1b-L3AD 120
P4 L5AD5-F ANK2c-R L5AD-ANK2c 140
P5 ANK2c-F ANK2d-R ANK2c-ANK2d 190
P6 ANK2d-F L3AD5-R ANK2d-L3AD 120
P7 ANK1b-F ANK2c-R ANK1b-ANK2c 190
*Tổng hợp các cấu trúc PTG bằng Golden Gate
Sau khi các mảnh thành phần được khuếch đại bằng PCR và cắt bằng BsaI, đầu dính dài 4 nucleotide được tạo thành giúp nối 2 mảnh thành phần để tạo thành một cấu trúc gRNA hoàn chỉnh (Hình 12B). Các mảnh P1, P2 và P3 được sử dụng để tạo cấu trúc PTG-ANK1, các mảnh P4, P5 và P6 được sử dụng để tạo cấu trúc PTG-ANK2, các mảnh P1, P2, P5, P6 và P7 được sử dụng để tạo cấu trúc PTG- ANK(1+2) (Bảng 4).
Sản phẩm PCR các mảnh thành phần tiếp tục được tinh sạch bằng QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) trước khi được đưa vào phản ứng Golden Gate. Thành phần phản ứng 20 µl bao gồm: 10 µl 2 X T7 DNA Ligase Buffer (132 mM Tris-HCl, 20 mM MgCl2, 2 mM ATP, 2 mM DTT, 15% PEG 6000, pH 7,6); 2 µl Bovine Serum Albumin (1 mg/ml); 0,5 µl BsaI (10 U/µl); 0,5 µl T7 DNA ligase (3000 U/µl) 25 ng mỗi mảnh PCR thành phần. Sau đó, phản ứng được thực hiện với