Đoạn trình tự mã hóa gen ANK1 và ANK2 trong vector nhân dòng pGEM-T được đưa vào vector PC5300.OE bằng công nghệ GATEWAY thông qua phản ứng tái tổ hợp giữa 2 vị trí attB1 x attP1 và attB2 x attP2, như vậy đoạn trình tự mã hóa gen ANK sẽ thay thế vị trí của gen ccdB, dưới sự điều khiển của promoter Ubiquitin.
Kiểm tra sự có mặt của đoạn DNA chèn trong vector PC5300.OE tái tổ hợp bằng phản ứng PCR với cặp mồi pUbi và ANK-R2 (Bảng 1). Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy 1 băng đặc hiệu tương ứng với kích thước mong đợi 1132 bp ở 10/10 khuẩn lạc sàng lọc (Hình 18A). Kiểm tra 15 khuẩn lạc biến nạp với vector PC5300.OE-CDS_ANK2 thu được 7 khuẩn dương tính (Hình 18C). Sự có mặt của gen ANK1, ANK2 trong vector PC5300.OE được khẳng định lại bằng phản ứng cắt enzyme giới hạn EcoRI, thu được 2 băng trong đó băng có kích thước bé hơn đúng với kích thước mong đợi của gen ANK1 (1720 bp) và ANK2 (2483 bp), còn băng có kích thước lớn hơn là phần còn lại của vector PC5300.OE (Hình 18B, D).
Hình 18. Kiểm tra sự có mặt của đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 trong vector PC5300.OE tái tổ hợp bằng PCR (A, C) và cắt enzyme giới hạn EcoRI
(B,D).
Thang chuẩn: GeneRuler 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific).
Giải trình tự các dòng biến nạp dương tính cho thấy tất cả các plasmid đều mang chính xác trình tự mã hóa các gen ANK1, ANK2. Như vậy, các trình tự mã
hóa ANK1, ANK2 đã được đưa vào vector biểu hiện PC5300.OE. Các plasmid sau đó đã được biến nạp vào chủng vi khuẩn Agrobacterium EHA105 chuẩn bị cho quy trình chuyển gen vào lúa, các thí nghiệm kiểm tra đã được tiến hành như đối với các dòng E.coli (PCR khuẩn lạc, cắt ezyme giới hạn).