Để sàng lọc đột biến, phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi được thiết kế nằm ở hai đầu của hai gRNA sử dụng cho mỗi gen. Đột biến (deletion) có thể quan sát được trên gel agarose nếu xuất hiện băng DNA thấp hơn so với ở cây đối chứng không mang cấu trúc chuyển gen.
Kết quả điện di sản phẩm PCR của các cây T0 mang cấu trúc Cas9-ANK1 cho thấy có sự xuất hiện của băng DNA thứ 2 thấp hơn so với băng DNA đặc hiệu ở cây đối chứng Kitaake (382 bp), như ở cây T0.Cas9-ANK1_1.8; T0.Cas9- ANK1_2.32 và T0.Cas9-ANK1_5.1, tuy nhiên khoảng cách giữa 2 băng không rõ ràng (Hình 36A). Kết quả giải trình tự cho thấy cây T0.Cas9-ANK1_1.8 dị hợp tử,
mỗi alen mất lần lượt 2 bp và 3 bp ở exon 4 của gen ANK1, cây T0.Cas9- ANK1_2.32 đồng hợp tử mất 1bp so với đối chứng, và cây T0.Cas9-ANK1_5.1 cũng có kiểu gen dị hợp tử trong đó 1 alen không bị đột biến và 1 alen mất 13 bp (Bảng 8).
Hình 26. Sàng lọc đột biến bằng PCR
A : các dòng T0.Cas9-ANK1, B : các dòng T0.Cas9-ANK2 ; C : các dòng T0. Cas9- ANK(1+2).Thang chuẩn: GeneRuler 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific).
Đối với các dòng Cas9-ANK2, phân tích kết quả điện di sản phẩm PCR (Hình 26B) và giải trình tự cho thấy trong số 15 dòng dương tính có 3 dòng mang đột biến mất đoạn từ 59-78 bp trong vùng exon 4 và là đột biến dị hợp (Bảng 8).
Đối với các dòng chuyển gen với cấu trúc Cas9-ANK(1+2), 2 phản ứng PCR được thực hiện để sàng lọc đột biến với 2 cặp mồi sử dụng trong sàng lọc các cấu trúc đơn. Từ hình ảnh điện di có thể thấy bốn dòng (22.61 và 60.12; 60.23; 60.27) có băng DNA với kích thước khác biệt so với đối chứng (Hình 26C). Hai dòng 22.61 và 60.12 đã được giải trình tự, nhưng không phân tích được kết quả do hình ảnh bị nhiễu. Các dòng này sẽ được phân tích và giải trình tự lại ở thế hệ tiếp theo.
Bảng 8. Kết quả phân tích đột biến các gen ANK1, ANK2 ở các cây chuyển gen thế hệ T0
Dòng chuyển gen T0 Kiểu gen
T0.Cas9-ANK1_1.8 Dị hợp (-2 bp/-3 bp) T0.Cas9-ANK1_2.32 Đồng hợp (-1 bp/-1 bp) T0.Cas9-ANK1_5.1 Dị hợp (-13 bp/WT) T0.Cas9-ANK2_2.1 Dị hợp (-60 bp/-59 bp) T0.Cas9-ANK2_4.131 Dị hợp (-59 bp/WT) T0.Cas9-ANK2_5.10 Dị hợp (-59 bp/-78 bp) T0.Cas9-ANK(1+2)_22.61 Chưa xác định T0.Cas9-ANK(1+2)_60.12 T0.Cas9-ANK(1+2)_60.23 T0.Cas9-ANK(1+2)_60.27
WT: wild-type, không mang đột biến.