pGEM-T Easy
Sản phẩm PCR3 sau khi được tinh sạch và gắn thêm adenin được đưa vào vector pGEM-T Easy ở vị trí mở vòng T/T nhờ T4-DNA ligase. Plasmid sau đó biến nạp vào vi khuẩn E.coli TOP10 và sàng lọc trên môi trường thích hợp. Sau một đêm nuôi cấy xuất hiện 2 loại khuẩn lạc màu trắng và màu xanh. Sáu khuẩn lạc màu trắng được kiểm tra sự có mặt của đoạn DNA chèn trong vector nhân dòng bằng PCR với cặp mồi T7-SP6. Kích thước mong đợi của sản phẩm PCR ở các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp là 1144 bp và 1346 bp tương ứng cho 2 gen ANK1, ANK2.
Đối với các khuẩn lạc tự đóng vòng, kích thước sản phẩm PCR là 176 bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR (Hình 16A, B) cho thấy 2 băng DNA tương ứng với 2 gen
ANK1, ANK2 gần đúng với kích thước mong đợi, như vậy các khuẩn lạc kiểm tra là dương tính. Kết quả kiểm tra plasmid bằng enzyme giới hạn EcoRI thu được 2 băng DNA, một băng có kích thước khoảng 3.0 kb là kích thước nguyên bản của vector pGEM-T Easy, băng thứ hai là đoạn DNA chứa trình tự ANK1, ANK2 (Hình 16C, D). Các kết quả thu được cho phép khẳng định đã đưa được đoạn DNA với kích thước như trình tự mã hóa ANK1, ANK2 vào vector pGEM-T.
Hình 16. Kiểm tra sự có mặt của đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 trong vector pGEM-T tái tổ hợp bằng PCR và cắt enzyme giới hạn.
A, B: sản phẩm PCR khuẩn lạc với mồi T7-SP6. C, D: sản phẩm cắt plasmid với enzyme EcoRI. Thang chuẩn: GeneRuler 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific).
Kết quả giải trình tự các plasmid thu được bốn/sáu dòng mang đầy đủ, và chính xác trình tự mã hóa gen ANK1 và các trình tự attB1-attB2 (Hình 17B). Tuy nhiên khi phân tích trình tự của 6 cấu trúc pGEM-T_CDS_ANK2 đều nhận thấy sự thiếu hụt 186 bp (toàn bộ vùng exon 2) so với trình tự tham chiếu (Hình 17C). Trình tự tham chiếu của ANK2 công bố trên các cơ sở dữ liệu là trình tự được dự đoán dựa trên các phân tích tin sinh của trình tự nucleotide trên DNA, ANK2 chưa từng được nghiên cứu trước đây, do đó, có thể vùng 186 bp (exon 2 trong trình tự tham chiếu) trên thực tế có thể là vùng không mã hóa (intron) hoặc đây là một dạng mRNA của ANK2. Để kiểm tra giả thiết này, đoạn trình tự mã hóa gen ANK2 đã được phân lập lại từ mẫu bông non của giống lúa mô hình Kitaake và giải trình tự, kết quả thu được trình tự trùng khớp với trình tự của đoạn mã hóa gen ANK2 được phân lập từ giống Nipponbare, đều thiếu 186 pb so với trình tự tham chiếu được công bố trên các trang dữ liệu.
Phân tích cấu trúc protein từ trình tự thu được cho thấy gen ANK2 mã hóa protein với 4 motif ankyrin, 3 motif TPR (trong khi trình tự tham chiếu tạo ra protein có 5 motif ankyrin, 3 motif TPR) tuy nhiên vẫn có thể tạo ra một vị trí liên kết với một phối tử sinh học khác.
Hình 17. Kết quả phân tích trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 trong vector pGEM-T Easy tái tổ hợp.
A : Vị trí mồi T7 và SP6 trong vector pGEM-T Easy sử dụng để giải trình tự đoạn DNA chèn. B : Trình tự đoạn mã hóa gen ANK1 từ mã mở đầu đến mã kết thúc và trình tự attB1, attB2. C : Cấu trúc gen ANK2 công bố trên cơ sở dữ liệu Rice Genome Annotation và cấu trúc phân tích từ dữ liệu giải trình tự của đề tài.