Quá trình phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 từ cDNA tổng số của mẫu bông non giống lúa Nipponbare được thực hiện bằng 3 phản ứng PCR lồng. Phản ứng PCR vòng 1 được thực hiện với cặp mồi thiết kế bắt cặp ở vùng 3’-UTR và 5’-UTR của mỗi gen, kích thước mong đợi của sản phẩm PCR1 là 1342 bp và 1378 bp tương ứng cho 2 gen ANK1 và ANK2. Kết quả điện di sản phẩm PCR1 cho thấy 1 băng DNA gần đúng với kích thước mong đợi của gen ANK2 trong khi đó không quan sát được băng tương tự cho gen ANK1 (Hình 15A). Biểu hiện của gen
ANK1 được báo cáo ở mức độ rất thấp ở giai đoạn hình thành bông non, do đó lượng sản phẩm PCR1 không đủ để quan sát trên gel điện di, tuy nhiên vẫn có thể sử dụng để tiếp tục khuếch đại ở các phản ứng vòng trong.
Phản ứng PCR vòng 2 sử dụng cặp mồi bắt cặp ở hai đầu vùng trình tự mã hóa mỗi gen nhằm phân lập toàn bộ đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2. Hình ảnh điện di cho thấy sản phẩm PCR2 của cả 2 gen không đặc hiệu, tuy nhiên có băng DNA có kích thước gần như mong đợi 909 bp và 1116 bp (Hình 15B). Băng DNA đặc hiệu sau đó được cắt ra khỏi gel và tinh sạch để sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR3.
Phản ứng PCR vòng 3 nhằm gắn thêm đoạn trình tự attB1 (29 bp), attB2 (30 bp) vào đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 phục vụ gắn chúng vào vector PC5300.OE. Hình ảnh điện di sản phẩm của phản ứng PCR3 cho thấy 2 băng đặc hiệu gần đúng với kích thước mong đợi của gen ANK1 là 968 bp và gen ANK2 là 1175 bp (Hình 15C).
Hình 15. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phân lập đoạn trình tự mã hóa gen
ANK1 và ANK2
A: sản phẩm PCR vòng 1. B: sản phẩm PCR vòng 2. C: sản phẩm PCR vòng 3. L: Thang chuẩn: GeneRuler 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific).