* Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E.coli bằng phương pháp sốc nhiệt
50 µl tế bào khả biến E.coli TOP10 (INTROGEN) được rã đông trên đá (5 phút). Bổ sung 2 µl plasmid, trộn đều nhẹ nhàng và ủ trong đá 30 phút. Quá trình gây sốc nhiệt được tiến hành trong bể ổn nhiệt ở 42°C, 50 giây rồi ngay lập tức làm lạnh ống vi khuẩn trong đá 5 phút. Nuôi phục hồi vi khuẩn trong LB lỏng ở 370C, 200 vòng/phút trong vòng 1 giờ. Trải đều 100 µl và 200 µl dịch khuẩn trên bề mặt môi trường sinh trưởng LB (25 ml) bổ sung 100 mg/l Ampicillin, 100 µl IPTG (100 mM) và 20 µl X-Gal (50 mg/ml), nuôi cấy qua đêm ở nhiệt độ 370C. Sau đó, đĩa nuôi cấy được đặt ở 40C trong 2 giờ nhằm tăng sự khác biệt chọn lọc màu xanh/ trắng. Các khuẩn lạc màu trắng được chọn lọc, tiếp tục nuôi cấy trong 5 mL môi trường LB lỏng và 100 mg/l ampiciline, lắc 200 vòng/phút qua đêm ở 37°C để tách chiết DNA plasmid.
*Biến nạp plasmid vào vi khuẩn A. tumefaciens bằng phương pháp sốc điện
50 µl tế bào vi khuẩn EHA105 được làm tan hoàn toàn trong đá lạnh sau khi lấy từ -800C, trộn đều vi khuẩn với 2 µl plasmid, chuyển hỗn hợp sang cuvette 2 mm (đã được làm lạnh trước đó) (BTX Harvard apparatus). Tiến hành sốc điện sử dụng dòng điện 1800 V, 200 Ʊ, 25 µF với máy sốc điện ECM 399 Electroporation
System, BTX Harvard apparatus. Tế bào vi khuẩn sau khi sốc điện được nuôi hồi phục trong 950 µl LB lỏng ở 280C, lắc 200 vòng/phút trong vòng 2 giờ. 50 – 100 µl dịch khuẩn được trải đều lên đĩa môi trường LB bổ sung kháng sinh kanamycin (50 mg/l) và rifamycin (25 mg/l), chọn lọc khuẩn lạc dương tính sau 48 giờ nuôi khuẩn ở 280C. Các khuẩn lạc xuất hiện được chọn ra và tiếp tục nuôi trong ống Flacon 50 ml chứa 5 ml môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh kanamycin (50 mg/l) và rifamycin (25 mg/l), lắc 200 vòng/phút, qua đêm ở 280C để tách chiết plasmid.
*Tách chiết plasmid
Tất cả các plasmid từ E.coli và A. tumefaciens đều được tách chiết bằng kit GeneJET Plasmid Miniprep Kit dựa trên phương pháp ly giải bằng ankaline kết hợp với một màng silica tinh sạch (#K0503, Thermo Scientific, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Plasmid thu được khi rửa giải màng tinh sạch với 50µl dung dịch Elution Buffer và được lưu giữ ở -200C.
*Cắt DNA bằng enzyme giới hạn
Các phản ứng cắt DNA plasmid bằng enzyme giới hạn được thực hiện với các kít của hãng Thermo Fisher Scientific bao gồm enzyme và dung dịch đệm thích hợp. Theo hướng dẫn của nhà sản xuất, mỗi phản ứng được thực hiện trong thể tích 20 µl bao gồm DNA, enzyme giới hạn và dung môi. Các phản ứng cắt trong đề tài này sử dụng các enzyme EcoRI, BamHI, SalI, BsaI, FokI hoạt động tối ưu ở 370C. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 370C trong 1 giờ, sau đó được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose.
* Điện di
Gel agarose (#R0492, Fermentas) được pha trong đệm 0.5 X TRIS-Acetate- EDTA (TAE) nồng độ 0,7% - 3%, tùy thuộc vào kích thước DNA. Bản gel được đặt trong bể chứa dịch đệm TAE 0.5 X. Các mẫu được trộn với thuốc nhuộm Loading dye (#R0611, Fermentas, USA) với tỉ lệ thích hợp sau đó được cho vào giếng điện di trên gel, chạy điện di ở 100 V – 40 phút. Bản gel sau đó được nhuộm trong dung dịch Ethidium Bromide (0,5 µg/ml) trong vòng 20 phút, rửa lại trong bể nước cất 10
phút và soi trong buồng UV (Uvltec, Cambridge) và phần mềm Fire Reader. Các thí nghiệm điện di sử dụng thang chuẩn DNA Gene Ruler 1kb (#SM1163, Fermentas).
* Các phản ứng khuếch đại DNA (PCR)
Các phản ứng PCR trong quá trình phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2: Sử dụng “Phusion II High Fidelity DNA polymerase Kit” (F-549S/L, Thermo Scientific, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các phản ứng PCR được thực hiện trong thể tích 50 µl bao gồm 50 ng khuôn DNA, 0,1mM dNTPs (#R0182, Fermentas, ThermoScientific, USA), 0,1 µM mỗi mồi đặc hiệu (mồi xuôi và mồi ngược), 10 µL dịch đệm 5 X Phusion HF Buffer, 0,5 µl Phusion Hot StartII DNA polymerase (2 U/µl) và bổ sung thêm nước cất hai lần. Một phản ứng PCR được tiến hành theo chu trình nhiệt: 98ºC – 30 giây và tiếp tục với 35 chu kỳ “ tách mạch 98ºC – 10 giây, gắn mồi Ta – 30 giây, và kéo dài mạch thực hiện ở 72ºC – 30 giây cho đoạn khuếch đại 1kb”, sản phẩm được ổn định ở 72ºC – 10 phút và giữ ở 200C – 10 phút.
Các phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc: Sử dụng “Dream Taq DNA polymerase” (Thermo Scientific) với thể tích phản ứng 20µl. Phản ứng được tiến hành với chu trình nhiệt: 94ºC – 5 phút hoạt hóa Dream Taq DNA polymerase, 30 chu kỳ nhiệt “94ºC – 30 giây, Ta – 30 giây nhiệt độ gắn mồi , kéo dài mạch ở 72ºC – 1 phút cho 1kb”, ổn định sản phẩm ở 72ºC– 1 phút và giữ sản phẩm ở 10 phút– 25ºC. Một phản ứng PCR bao gồm 10 X Dream Taq Buffer (#R0971, Fermentas, USA), 0,5 µl dNTPs (10 mM) (#R0182, Fermentas, USA), 0,5 µl mỗi mồi (10 µM – mồi xuôi và mồi ngược), 0,1 µl Dream Taq DNA polymerase (#EP0702) và nước cất.
Các phản ứng PCR kiểm tra plasmid, cây chuyển gen: Các phản ứng PCR kiểm tra plasmid và cây chuyển gen được thực hiện tương tự như ở các khuẩn lạc trong đó sử dụng 20 ng mẫu khuôn DNA thay thế cho mẫu khuẩn lạc.
Các phản ứng PCR được thực hiện trên máy Prime Thermal Cyclers (Bibby Scientific Limited, UK).
Phản ứng qRT-PCR được thực hiện trong thể tích 10 µl sử dụng kit GoTaq qPCR Master Mix (Promega). Sử dụng đối chứng âm là mẫu nước và gen ACTIN
(Os01g73310) là gen tham chiếu.
Hiệu suất của mồi được tính toán bằng cách xây dựng đường chuẩn (StDNAard curve). Pha loãng mẫu cDNA theo hệ số pha loãng 10 (1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320). Đường chuẩn cho mỗi cặp mồi được xây dựng với các giá trị Ct thu được ở 6 nồng độ pha loãng như trên. Hai thông số được hiển thị trên mỗi đường chuẩn để đánh giá hiệu quả PCR E (Efficiency) và hệ số tương quan R2. E được tính theo công thức của Pfaffl E=10^-(1/slope) [36]. Trong đó slope là giá trị a trong phương trình biểu diễn đường chuẩn y= ax+b. Hiệu suất của mồi tốt, đủ điều kiện để thực hiện phản ứng qRT-PCR nếu 1,8 < E < 2,2 và giá trị R2 >0,9.
Phản ứng qRT-PCR được thực hiện trên máy Agilent Technologies Mx 3005p (Stratagene) với chu trình như sau: 95°C trong 10 phút để kích hoạt enyme, 40 chu kỳ của 95°C (15 giây) và 60°C (1 phút).
*Giải trình tự và phân tích dữ liệu
Tất cả các plasmid, sản phẩm PCR được giải trình tự DNA theo phương pháp Sanger tại Macrogen (Hàn Quốc) với các cặp mồi trình bày ở bảng 1 tương ứng cho từng thí nghiệm.
Sử dụng các phần mềm phân tích tin sinh như BioEdit hay BLAST/NCBI để phân tích, so sánh các trình tự nhân dòng với các trình tự tham chiếu của gen hay của các gRNA thiết kế. Các công cụ CRISP-ID/DSDecodeM được dùng để tìm kiếm các đột biến gây ra bởi CRISPR/Cas9 ở các cây chuyển gen.
Sử dụng các công cụ ExPASy, SMART để phân tích trình tự và motif cấu hình các chuỗi polypeptide.
Các đồ thị, số liệu thống kê của nghiên cứu được xây dựng trên phần mềm thống kê R.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN