ANK2
*Sàng lọc cây chuyển gen thế hệ T0
Để kiểm tra sự có mặt của T-DNA trong cây tái sinh, phản ứng PCR được thực hiện trên gDNA, với cặp mồi được thiết kế khuếch đại một vùng trình tự của gen HPT (HPT-OE-F, HPT-OE-R: Bảng 1) sử dụng Dream Taq DNA polymerase Kit (Thermo Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các dòng chuyển gen có băng DNA đúng với kích thước mong đợi (999 bp) được kiểm tra trình tự T-DNA chèn vào hệ gen bằng phản ứng PCR với cặp mồi pUBI và pCaMV35S, sản phẩm của phản ứng được giải trình tự và so sánh với trình tự tham chiếu.
*Sàng lọc cây chuyển gen T1 mang 1 bản sao T-DNA bằng qRT-PCR
Số lượng bản sao của T-DNA trong các dòng lúa chuyển gen T1 được đánh giá bằng kỹ thuật qRT-PCR theo mô tả của Zhang và cộng sự [50]. Phản ứng qRT- PCR được thực hiện với khuôn là gDNA được tách chiết từ lá, sử dụng cặp mồi đặc hiệu HPT-CDS-F, HPT-CDS-R bắt cặp trong vùng gen HPT. Sử dụng gen SPS
(Sucrose phosphate synthase) chỉ có 1 bản sao trong hệ gen lúa làm gen tham chiếu nhằm xác định số lượng bản sao T-DNA. Số lượng bản sao T-DNA được đánh giá dựa vào tỷ lệ bản sao so với gen tham chiếu, theo công thức:
Ratio=2Ct reference−Ct transgene
Trong đó, Ct reference là chu kỳ ngưỡng của gen tham chiếu SPS, Ct transgene là chu kỳ ngưỡng của gen HPT.
Nếu tỷ lệ này = 1: cây chuyển gen chỉ mang 1 bản sao T-DNA và đồng hợp tử. Nếu tỷ lệ là 0,5: cây chuyển gen chỉ mang 1 bản sao T-DNA nhưng dị hợp tử. Tỷ lệ lớn hơn 1: cây mang nhiều hơn 1 bản sao T-DNA.
*Đánh giá mức độ biểu hiện của gen ANK1, ANK2 ở các cây chuyển gen T1 bằng qRT-PCR
Biểu hiện của gen trong cây chuyển gen được đánh giá bằng kỹ thuật qRT-PCR sử dụng khuôn là cDNA . Các cặp mồi sử dụng cho các gen ANK1 (CDS-ANK1-F, CDS-ANK1-R), ANK2 (CDS-ANK2-F, CDS-ANK2-R) và gen tham chiếu ACTIN
(Actin-F, Actin-R) được trình bày ở bảng 1.
Mức độ biểu hiện tương đối của gen giữa cây chuyển gen và cây đối chứng được đánh giá theo công thức:
Trong đó, Etarget, Eref lần lượt là giá trị E của các mồi dùng cho gen đích và gen đối chứng; ΔCPtarget(control-sample), ΔCPref(control-sample) lần lượt là hiệu số chu kỳ ngưỡng của gen đích và gen tham chiếu ở cây đối chứng và cây chuyển gen [36].
Phân tích thống kê bằng phương pháp Student-ttest với p<0,05 .